摘要：从黑松林地土壤中分离得到一株对越橘叶斑病原菌Cylindrocladium colhounii有较强抑制作用的细菌B7。建立该细菌的生长曲线。采用菌丝生长抑制法，研究了该细菌对C.colhounii的拮抗作用，并通过正交试验优化了其发酵条件。结果表明，该菌体在培养了5 h后即进入对数生长期；B7细菌的发酵液原液和无菌滤液均能抑制病原菌的生长，其中发酵液原液的103稀释液的抑菌效果仍与对照之间存在显著的差异；发酵条件优化试验中发现该细菌的无菌滤液最大抑菌率达100％，最佳发酵条件为葡萄糖0.5％、氯化铵0.1％、不加无机盐、pH 5.4，温度28℃；结合形态学特征和16S rRNA的序列分析，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。
关键词：越橘；Cylindrocladium colhounii；枯草芽孢杆菌；正交试验；16S rRNA
中图分类号：S436.631.1；S476 文献标识码：A
文章编号：1009-9980(2008)03-426-05
越橘，作为保健和功能食品，已被国际粮食组织列为人类五大健康保健食品之一，市场前景喜人。近年来，在山东、江苏、辽宁等地开始了大面积的栽培生产，规模正在不断扩大，已成为最具发展潜力的果树树种之一。与此同时。由于环境条件的影响，病虫害开始出现。本实验室在辽宁大连和丹东的越橘种苗繁育基地发现了一种为害较为严重的叶斑病害，给生产造成了巨大的经济损失。经分离鉴定，确认该病的致病菌为Cylindrocladium colhounii。此前，有报道认为该菌能引起鸡冠花的褐腐病、鹤望兰的叶斑病。同时该菌能危害花生、大叶桉、红叶层、鹿蹄草等多种观赏类植物。
利用拮抗细菌防治果树真菌性病害的报道已有很多。然而，对于C.colhounii菌的生物防治一直没有相关的报道。2006年，我们用银杏外种皮提取物抑制该病原菌，取得了很好的效果。但由于所需的原材料价格偏高且来源较少，不适合大规模生产。作者旨在筛选出有较强且稳定抑制作用的拮抗菌株，并从碳源、氮源、无机盐、温度及pH值等方面对其发酵条件进行优化，为进一步的生物防治，尤其是微生态防治奠定基础。
1 材料和方法
1．1 培养基
细菌的分离、纯化分别采用PDA和BPY培养基，种子培养基为液体BPY。
正交试验中各种发酵培养基的组成参照BPY确定为碳源0.5％、氮源0.1％、无机盐0.5％，pH设置4个梯度。
1．2 供试病原菌株
真菌病原菌株C.colhounii由本实验室从发病的越橘植株中分离鉴定，作为指示菌。
1．3 土样采集与拮抗菌株的分离筛选
2006年4月于大连理工大学的多年生黑松树林内，采用5点取样法，采集根际区域表层15 cm以下土壤，取各土样42 g加入装有200 mL无菌水的三角瓶中，放入玻璃珠振荡30 min，将悬浊液依次稀释10、102、103、104、105倍。在分离培养基正中间放置一直径为7 mm的指示菌菌饼，在距指示菌菌饼边缘1.5 cm处对称的放置4片直径为1 cm灭菌圆形滤纸片，其上滴加1 mL的悬浊液。每个浓度3次重复。待长出菌落后，挑取对指示菌有明显抑制作用的菌落，进行划线纯化。将纯化后的单菌落移至BPY斜面上，37℃培养。
1．4 拮抗细菌生长曲线的绘制
参照周德庆的方法，将菌液稀释5倍后测量、绘制菌体的生长曲线。
1．5 发酵液抑菌活性的测定
10 pmol，ddH2O补足至50μL。扩增条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸90s，共30个循环，最后72℃延伸8 min。取4 μL扩增产物，用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳：产物测序由TaKaRa(大连)公司完成。通过NCBI数据库搜索与测序结果相近序列对该菌株进行初步鉴定。
2 结果与分析
2．1 菌种的筛选
经过反复的筛选，从16株细菌中分离纯化到了1株抑菌效果较好的细菌，命名为B7。并将该菌种于70℃条件下保藏，备用。
2．2 菌体生长曲线的绘制
根据该细菌在BPY中不同培养时间的D600nm值绘制了菌体生长曲线(图1)。可以看出，培养5 h后菌体进入对数生长期。9 h后进入稳定期。12 h后进入衰退期。由此初步判定要收集菌体或抑菌物质，应在细菌培养12 h后进行。
2．3 发酵液抑菌活性的测定
B7细菌摇瓶培养16 h后测定其菌体密度，稀释5倍后D 6G0nm为0.64。B7细菌发酵液无菌滤液及不同浓度发酵液原液对C.colhounii菌丝生长的影响状况及其各自的抑菌率列于表2。可见，对于不同浓度的发酵液原液，所有的处理均有抑制病原菌的作用，其中发酵液原液稀释102倍后的抑菌效果与其原倍液差异不显著，而稀释102倍后菌体生长直径与对照组之间仍有显著的差异，这充分证明发酵液原液有较好的抑菌效果；对于发酵液的无菌滤液，抑菌率为86，6％，这与发酵液原倍液及其lO倍稀释液的抑菌效果相当，由于此处理消除了菌体竞争作用抑菌的影响，故证明了发酵液中确实存在抑菌物质。综上可知，发酵液原液和发酵液的无菌滤液均对病原菌有较好的抑制作用，但各处理的抑菌率未达到100％，所以考虑优化发酵条件以提高其抑菌率。
2．4 拮抗细菌发酵培养条件优化
16个处理中的最佳发酵组合为葡萄糖O，5％、氯化铵0，1％、不加无机盐、pH 5，4、培养温度28℃，其24 h发酵液的无菌滤液抑菌率可以达到100％(图2)，与之前的发酵条件相比，无菌滤液的抑菌效果显著提高(图3)，故将此作为该菌的最佳发酵条件：极差分析结果表明各因素对发酵产物活性大小的影响顺序为温度>碳源>氮源>无机盐>pH：方差分析结果显示温度和碳源对发酵产物活性的影响达到了极显著，氮源和无机离子达到了显著，pH值的影响不显著。
2．5 拮抗细菌的鉴定
在BPY固体培养基上菌落形态、大小、颜色均匀一致，都长成了圆形黄色的单菌落，表面干燥无光、呈褶皱状。边缘整齐，菌落扁平且不透明。在BPY液体培养基中，菌液均匀浑浊，试管底有菌体沉淀产生。液面无菌膜。生长了24 h的B7细菌。经结晶紫染色在镜下菌体呈杆状，大小为1.86μm×1.04 μm，有较少的芽胞形成。革兰氏染色为阳性。
将PCR扩增得到的特异性产物进行测序，得到长度为1466 bp的片段(已提交GenBank)，将该序
列在GenBank中进行BLAST比对，发现与已报道的2株Bacillus subtilis (登录号：DQ520955)
3 讨论
20世纪90年代以来，由于化学防治方法的弊端愈加突出，人们逐渐将目光转向生物防治，尤其是对于像越橘这样以食用果实為目标的作物，更显得重要。有益微生物是人们关注的一个焦点，其中芽孢杆菌作为植物微生态防治的优势种群，具有较强的抗菌防病作用，已成功地用于植物病害的生物防治，而且很多已经作为生物农药广泛应用。而利用生防细菌对越橘叶斑病原菌C.colhounii进行防治一直没有相关的报道。本实验首次将枯草芽孢杆菌用于该病的生物防治，并且取得了较好的防治效果。
本研究筛选出的生防细菌B7，无论是其不同浓度的发酵原液或是无菌滤液均对病原菌C.colhounii有较好抑制作用，证实了该菌分泌了抑菌物质。但实验中我们发现发酵原液的无菌滤液的抑菌作用要好于发酵原液，而在发酵条件优化后其抑菌率更是能够达到100％。这一结果与之前的报道很相似，分析其可能的原因主要有两方面。第一，优化后的发酵条件更有利于该细菌产生抑菌物质：第二，发酵时间适当延长，产生的抑菌物质增多。
我们已有利用植物源提取物抑制病原菌C，col-hounii的报道。但比较而言，本实验采用的微生物防治方法在达到相同抑菌效果的基础上更有其自身的特点，比如原料来源广泛，使用方便。污染更小，生产周期短以及抗逆能力作用很强等。此外，本研究筛选的菌株源于土壤，具有较强的生物安全性。最后，B7细菌发酵条件的优化实验结果表明，该菌对pH值的适应范围较广，而温度和碳源对其产生抑菌物质的影响显著，故实际生产中应着重考虑这2个因素，以得到最佳的发酵效果。
4 结论
筛选得到一株对越橘叶斑病原菌C.colhounii有较强抑制作用的细菌(B7)，经形态学特征和16SrRNA的序列分析，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。B7细菌的发酵液原液和无菌滤液均能抑制病原菌的生长，发酵条件优化后该细菌的无菌滤液最大抑菌率达100％。该菌的最佳发酵条件为葡萄糖0.5％、氯化铵0.1％、不加无机盐、pH 5.4，温度28℃，其中影响抑菌物质产生的较大因素是碳源和温度。这一结果为B7细菌的实际开发利用奠定了基础。
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