汉中黑稻花青素合成酶基因克隆及生物信息学分析

材料与方法

1.1试验材料

本研究以陕西汉中地区种植的黑宝（HB）、黑丰（HF）、黑帅（HS）、黑米A（HMA）、黑米B（HMB）、黑优粘（HYZ）、培811（P811）等7种黑稻为材料，均为籼稻，由陕西省水稻研究所提供。

Taq酶、胶回收试剂盒等购自西安沃尔森生物技术有限公司。

1.2试验方法

1.2.1ANS序列的克隆 种子在调温调湿箱中进行萌发，取水稻嫩叶叶尖，CTAB法提取基因组DNA。ANS基因PCR扩增的引物根据籼稻ANS基因序列（GenBank：Y07955）设计，ANS-F：GGG AGG GCG ACA TGA CGG；ANS-R：CGAGTC TTT CCA TCC CTA TT。PCR扩增体系为50μL，程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环，72℃ 10 min，4℃保存。采用1%琼脂糖经小量胶回收试剂盒（博日，杭州）回收目的片段。

1.2.2测序、序列比对、系统进化树和同源树分析 PCR纯化产物直接进行测序，测序由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成；序列组装、拼接和比对由DNAMAN完成。在NCBI中下载下列物种ANS基因序列（蒲竹仔，In：KF268002；小麦，Wh：AB247921；鹤望兰，St：KC484623；葡萄，Gr：EU156063；荞麦，Bw：HNl49791；白菜，Ca：AY228485）。进化树由MEGA5.0构建，同源树由DNAMAN完成。

1.2.3氨基酸序列的生物信息学分析 由DNAMAN对ANS氨基酸序列进行比对，使用在线软件ProtParam进行氨基酸理化性质预测，在线网站PSORT进行亚细胞定位预测，通过TMHMM Sever 2.O工具进行跨膜区预测，利用Signal P 4.1进行信号肽预测，利用Target P1.1Server进行导肽预测，通过在线Net Phos2.0进行磷酸位點预测，由NCBI保守域结构库（Conserved Domain Search，CDD）进行保守结构域预测，运用SOPMA法进行二级结构分析预测，使用Swiss-Model进行三级结构预测。

2结果与分析

2.1ANS基因序列对比分析及聚类分析和同源性分析

2.1.1ANS基因序列对比分析 NCBI检索到籼稻ANS基因全长1 606 bp，5’UTR长54 bp，3’UTR长424 bp，开放阅读框长为1 128 bp。通过BLAST分析，检索到NM_001064654与籼稻ANS基因高度相似（96%），且长度与粳稻一致，判断该基因为粳稻ANS基因。根据籼稻ANS基因的序列，设计相关引物用来扩增汉中7种黑稻ANS基因，通过DNAMAN对克隆序列进行拼接，获得黑稻ANS基因序列。7种黑稻ANS基因长度一致，开放阅读框全长1128 bp，编码375个氨基酸，7种汉中黑稻ANS基因存在两种序列，可以分为黑稻1（BR1）和黑稻2（BR2）两类，其中黑稻1包括黑宝和黑米B，黑稻2包括剩余5种汉中黑稻。以籼稻序列为标准，对汉中黑稻、粳稻ANS序列进行比对（图1），发现表示所选样本之间共存在20处SNPs，汉中黑稻与籼稻之间存在11处SNPs。汉中黑稻与籼稻之间的SNPs分别是588位的C/G颠换，594位的G/A转换，612位的C/G颠换，622位的G/A转换，630位的G/T转换，632位的T/A颠换，634位的G/C颠换，635位的C/A转换，657位的C/T转换，927位的A/C转换，1006位的G/A转换，1 059位的G/T转换。

2.1.2ANS基因序列聚类分析和同源性分析 通过近邻相接法（neighbOF-joining method，NJ）将黑稻的ANS序列与NCBI中获得不同物种ANS序列构建了进化树（图2-A）。黑稻1和黑稻2聚为一类，又依次与籼稻、粳稻、蒲竹仔、小麦聚为禾本科一类；鹤望兰、葡萄、白菜、荞麦聚为一类，说明ANS基因可以用来区分不同种属的植物，但同一种属的植物基本区分不出来。同时对ANS序列进行同源性分析，并构建了同源树（图2-B）。在参与序列比对的物种中，各物种的聚类与其植物学分类及种属特性基本相符，黑稻1和黑稻2与所参与比对的其他植物的同源性均在60%以上，与籼稻、粳稻的同源性高达99%，说明ANS是一个较为保守的基因，汉中黑稻ANS与其他植物ANS有较高的同源性。通过聚类分析和同源性分析发现，在参与ANS序列比对的所有物种中，各物种的聚类分析、同源分析与其植物学分类及种属特性基本相符，说明ANS可以用来研究不同种属之间的同源进化关系是较为可靠的，能够区分出不同种属的植物，但同一种属不同品种的植物基本上是区分不出来，不能用于区分同一植物的不同品种。

2.2黑稻ANS氨基酸的生物信息学分析

2.2.1黑稻ANS氨基酸分析及基本理化性质分析 对籼稻、黑稻1、黑稻2、粳稻ANS氨基酸序列对比（图3），籼稻与粳稻存在7个aa的差异，水稻之间则存在11个aa的差异，黑稻1、黑稻2与籼稻的aa差异分别为208位的G/R，210位的E/D，211位的L/Q，212的A/H，328位的Q/P，336位的G/D。

对籼稻、黑稻1、黑稻2、粳稻ANS的理化性质进行预测分析（表1），发现4种水稻ANS均属于稳定蛋白，根据总平均疏水性推测ANS为亲水性蛋白，黑稻的理论等电点和不稳定系数均略高于籼稻、籼稻。

2.2.2黑稻1ANS亚细胞定位、跨膜区、信号肽和导肽的分析 利用在线网站PSORT对黑稻1ANS蛋白进行亚细胞定位预测，结果如表2所示，推测该蛋白在细胞质中起作用。跨膜区是膜中蛋白与膜脂结合的主要部位，通过TMHMM Sever 2.0工具对ANS蛋白进行跨膜区预测，从图4可以看出该蛋白基本无跨膜区，全部在膜外。利用SignalP 4.1进行信号肽预测结果如图5、表3所示，由于最后得到黑稻1 ANS蛋白的平均信号肽分值为0.143（<0.5），故推测该蛋白不存在信号肽，不能分泌到细胞外，为非分泌性蛋白。利用TargetP1.1 Server进行导肽分析证实其不具有导肽（分值为0.071），见图6。

2.2.3黑稻1 ANS磷酸位点和保守结构域 磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质上的过程，基本上涉及整个生命活动中，故分析蛋白的磷酸化对研究蛋白质的功能有重要的意义。通过在线Net Phos2.0对黑稻1ANS磷酸位点进行预测分析（图7），共发现磷酸化位点15个其中丝氨酸磷酸化作用位点6个，苏氨酸磷酸化作用位点4个，酪氨酸磷酸化作用位点5个。利用NCBI CDD对黑稻1ANS进行保守结构域预测分析（图8），ANS蛋白质C端具有无血红素的加双氧酶（DIOXN）的结构域，属于D10XN超家族结构域，ANS蛋白质N端具有酮戊二酸二钠盐一二价铁离子_氨合酶结构域，属于20G-FeⅡ_Oxy加氧酶超家族。

2.2.4黑稻1 ANS二级结构和三级结构预测 蛋白质的二级结构是指肽链中的主链借助氢键，有规则的卷曲折叠成沿一维方向具有周期性结构的构象。运用SOPMA法对黑稻1 ANS蛋白的二级结构进行在线分析预测，结果显示该蛋白的二级结构由4种形式组成，α螺旋（α helix）、延伸链（Extended strand）、β转角（β turn）、无规则卷曲（Random coil），具体见图9、表4，由表4可以看出黑稻1 ANS主要由α螺旋和无规则卷曲组成。

利用SWISS-MODEL软件对黑稻1 ANS蛋白的2个保守结构域进行3D结构预测，结果（图10）显示的空间结构以螺旋和无规则卷曲为主，这与二级结构的预测结果相符。同时也对籼稻ANS蛋白进行了进行3D结构预测，发现二者存在一定的差异，推测ANS可能是花青苷合成中起重要作用的关键酶。

3讨论

汉中地处秦巴山区腹地，汉江上游，是陕西主要的水稻产区，水稻资源丰富，以五色稻最为著名，如洋县黑糯、汉中红香寸等知名品种，以陕西洋县黑米为代表的特种稻享誉省内外，种植时间悠久，民间自古相传有补血之效，成为馈赠珍品。汉中黑稻的研究主要集中种质资源、黑米有效成分检测分析提取、生物活性鉴定和功能产品开发等方面，还有研究者进行水稻DNA多样性研究及水稻蛋白质标记研究。但目前对汉中黑稻遗传基础的研究还不深入，特别是从分子水平上对其遗传多态性的研究鲜见报道。

花青索合成酶作为花青苷合成的关键酶，催化无色花色素形成相应的有色花色素，属于2-酮戊二酸双加氧酶家族。ANS是合成花青素的最重要基因，因为它的大量表达使3-氧花青苷和3-氧芍药苷大量积累，进而使果皮呈现紫黑色。Shih等将ANS转入相应的拟南芥突变体中，其子叶颜色由黄色转变为不同程度的紫色，说明ANS基因促进花青苷的积累。

7种汉中黑稻ANS基因序列可以分为黑稻1和黑稻2两种，ANS基因开放阅读框全长1128bp，编码375个氨基酸。通过ANS基因序列的对比，发现汉中黑稻还是与籼稻、粳稻之间存在一定的差异；系统进化树结果表明黑稻1和黑稻2与籼稻的亲缘关系较粳稻近，与实际情况相符，与禾本科植物较近的亲缘关系；同源性分析发现黑稻1和黑稻2与籼稻等植物的ANS具有高度的同源性，说明花青素合成酶保守性较高；氨基酸序列比对发现所黑稻1和黑稻2仅有326位氨基酸的不同，对水稻ANS蛋白理化性质预测，发现ANS蛋白属于稳定蛋白，与董娇预测的结果相同；黑稻1的ANS蛋白含有20G-FeⅡ_Oxy加氧酶典型的保守結构域。ANS蛋白三级结构预测，发现黑稻1和籼稻存在差异，推测ANS可能是花青苷合成中起重要作用的关键酶。ANS基因是一个古老的基因，可以作为种属鉴定的参考基因，可能是影响黑稻花青苷生物合成的主要基因之一。

（责任编辑：柯文辉）