摘要：线粒体膜通透性转换孔（MPTP）是线粒体内膜上的一种蛋白复合体，在细胞凋亡或坏死中具有重要作用。亲环蛋白D（CyPD）是MPTP的重要组成蛋白，对线粒体引起的细胞凋亡有重要的调节作用，但植物中该蛋白的研究较少。本试验通过PCR、RACE等分子生物学技术克隆获得了肥城桃果实线粒体CyPD基因cDNA序列，该序列全长663 bp，开放阅读框为615 bp，编码204个氨基酸；系统进化树分析发现，肥城桃CyPD与苹果CyPD蛋白在进化关系上最为亲密；蛋白质三维结构模拟表明，该蛋白含有2个α螺旋、8个β折叠结构；体外构建了pET-32a-CyPD重组表达载体，并成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。这些结果为进一步研究CyPD蛋白的结构和功能奠定了基础。
关键词：肥城桃；线粒体；CyPD；基因克隆；蛋白表达
中图分类号：S662.1：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0007-05
Abstract Mitochondrial membrane permeability transition pore （MPTP） is a kind of protein complex playing important roles in cell apoptosis and necrosis. Cyclophilin D （CyPD） plays roles in cell mitochondria-mediated apoptosis， which is an important part of MPTP. However， there are fewer researches on CyPD in plants. In this study， the full-length cDNA of CyPD was gained by molecular biology method. It was 663 bp， contained 615 bp of the coding sequence and encoded a polypeptide of 204 amino acids. The recombinant CyPD protein was expressed in Escherichia coli. The phylogentic tree revealed that CyPD was more closely related to apple CyPD protein in evolution. The three-dimensional structure of CyPD showed that the protein contained 2 α-helix and 8 β-pleated sheets. These results would lay a foundation for studying the structure and function of CyPD protein further.
Keywords Feicheng peach； Mitochondria； CyPD； Gene clone； Protein expression
线粒体是一种具有双层膜结构的半自主细胞器，除具有能量转化、三羧酸循环、氧化磷酸化及儲存钙离子等功能外[1-5]，还参与细胞凋亡、细胞分化和细胞信息传递等过程[6-8]。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，是自主有序的、多基因严格控制的过程[9]。Bcl-2基因的发现使人们认识到细胞凋亡过程的复杂性[10]，随着对细胞凋亡的深入研究，人们逐步认识到细胞凋亡有三条途径：膜受体途径、内质网途径和线粒体途径[11-13]。
线粒体通透性转换孔（MPTP）是线粒体上的一个特殊孔道。MPTP开放被认为是线粒体导致细胞死亡的众多途径中关键的一个，是细胞凋亡的限速步骤[14]。有研究表明，构成MPTP的主要蛋白包括：线粒体腺嘌呤核苷酸转运体（adenine nucleotide translocator，ANT）、亲环蛋白D（cyclophilin D，CyPD）、电压依赖型阴离子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）、F0F1-ATP酶（ATP synthase）以及磷酸盐载体（phosphate carrier，PiC）[15，16]。
CyPD是CyP蛋白家族的线粒体表型，是一种水溶性蛋白，有207个氨基酸，分子量约为20 kD。CyPD的N端有一段信号序列，使其定位于线粒体基质中，蛋白转运到线粒体后这段序列被切除[17]。CyPD在植物体生长和发育调节、代谢调控以及逆境应答方面均发挥重要作用，是线粒体通透性转变的主要调节元件之一。越来越多的证据显示，CyPD 参与多种因素所致的MPTP开放[18]，调节线粒体相关的细胞坏死过程[19，20]。
近年来，人们围绕CyPD开展了很多研究，但这些研究主要集中在动物CyPD蛋白，对植物中该蛋白的研究相对较少。本试验拟借助分子生物学手段，克隆获得肥城桃CyPD基因，对其进行生物信息学分析，并尝试体外表达CyPD蛋白，以期为进一步研究CyPD的结构与功能及在线粒体介导的细胞凋亡中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试桃品种为“大红袍”（Prums persica [L.]Batsch cv. Dahongpao），采摘于山东省肥城市肥城桃基地。选取大小均匀、无机械损伤、无病虫害的七成熟果实，采摘后运回实验室，4℃下过夜预冷。桃果实切块并液氮冷冻后于-80℃保存备用。
大肠杆菌E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）以及含pET-32a质粒的大肠杆菌均为本实验室保存，pMD18-T Vector、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、SMARTerTM RACE 5′/3′ Kit、T4 DNA Ligase均购自TaKaRa公司。
试验所用引物均由北京华大基因科技公司合成（表1）。
1.2 试验方法
1.2.1 肥城桃果实总RNA的提取及第一链cDNA的合成 桃果实总RNA的提取方法参照改良CTAB法[21]，并使用PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit将RNA反转录成第一链cDNA。
1.2.2 肥城桃果实线粒体CyPD基因中间序列的克隆 在NCBI网站的GenBank板块查找其它植物的CyPD基因序列，找出同源性较高片段，利用Primer Premier 5.0软件设计简并引物CyPD-S和CyPD-AS。以第一链cDNA为模板进行PCR扩增，将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后将目的条带切下，使用Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit试剂盒回收DNA片段。将DNA片段连接pMD18-T Vector，构建克隆载体，转化DH5α。筛选出阳性克隆，菌液PCR验证后，送华大基因科技公司进行测序。
1.2.3 肥城桃果實CyPD基因全长的获得及生物信息学分析 根据测序得到的中间片段序列，设计RACE引物GSP1、GSP2和巢式引物NGSP1、NGSP2。使用SMARTerTM RACE 5′/3′ Kit试剂盒进行3′-RACE和5′-RACE。将巢式PCR产物进行电泳并切胶回收，按前述步骤构建克隆载体，进行测序。将测序得到的5′端序列和3′端序列与中间序列进行拼接，得到CyPD基因全长。用DNAMAN软件推断其编码的氨基酸序列，并对不同物种的CyPD氨基酸序列进行比对分析，通过MEGA5.1软件构建CyPD蛋白系统进化树，使用在线网站SWISS-MODEL进行CyPD三维结构的模拟。
1.2.4 CyPD蛋白的体外表达 根据CyPD的编码区序列，设计含酶切位点的引物CyPD-1和CyPD-2，进行PCR，获得CyPD基因全长，使用pMD18-T Vector进行克隆载体的构建。克隆载体与pET-32a质粒经双酶切后分别回收目的条带，使用T4 DNA Ligase进行连接，获得重组质粒pET-32a-CyPD。将重组质粒导入BL21 （DE3），菌液PCR验证成功后进行体外蛋白表达。取200 μL菌液加入到100 mL新鲜的LB液体培养基，抗生素为氨苄。37℃恒温振荡培养，OD600=0.4～0.6时取1 mL菌液作对照，剩余菌液中加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃诱导过夜，对样品进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2 结果与分析
2.1 CyPD基因全长的获得
肥城桃CyPD基因中间片段的扩增结果如图1A所示，在230 bp左右出现目的条带，符合预期长度。将目的条带切胶回收并测序，根据测序结果设计RACE引物和巢式引物。RACE结果如图1B所示，3′和5′ RACE产物条带单一明亮，说明设计的引物特异性较好。将RACE产物切胶回收并测序，并将测序结果进行拼接，得到肥城桃CyPD基因序列。该基因长633 bp，用DNAMAN进行分析发现，该序列含有完整的开放阅读框，阅读框内含有615个碱基，编码204个氨基酸。
2.2 CyPD蛋白系统进化树分析
运用MEGA5.1构建CyPD蛋白系统进化树，在所选物种中，肥城桃CyPD蛋白与苹果CyPD蛋白在进化关系上最为亲密，和小麦、山羊草进化关系最远。其中肥城桃、苹果、油茶、麻风树的CyPD蛋白在进化关系上位于同一分支（图2）。
2.3 CyPD蛋白三维结构模拟分析
向SWISS-MODEL网站提交蛋白氨基酸序列进行结构分析，构建模型需要氨基酸序列识别度达到25%以上，以1dyw.1.A（识别度为71.86%）为模板构建CyPD蛋白结构模型。CyPD蛋白结构与模型蛋白结构拟合度较高，所有氨基酸相似度均在0.6以上（图3A）。从三维结构（图3B）可以看出，该蛋白中含有2个α螺旋、8个β折叠结构。
2.4 CyPD蛋白体外表达
CyPD基因片段与pET-32a质粒经T4 DNA Ligase连接，获得重组质粒pET-32a-CyPD，将其导入BL21 （DE3），经IPTG诱导表达，获得CyPD重组蛋白。电泳结果如图4所示，CyPD重组蛋白表达成功，分子量约为38 kD，表达量较高。
3 讨论与结论
本试验采用同源克隆的方法，获得了肥城桃CyPD基因中间片段，然后根据中间片段设计RACE引物，获得了5′端和3′端序列，经过序列拼接得到了准确的CyPD基因cDNA全长。CyPD蛋白系统进化树表明肥城桃CyPD蛋白与苹果CyPD蛋白在进化关系上最为亲密，蛋白三维结构模拟表明该蛋白含有2个α螺旋、8个β折叠结构。之后体外重组了pET-32a-CyPD克隆载体，并在BL21（DE3）中成功表达获得CyPD重组蛋白。
CyPD的主要特征是具有肽脯氨酰顺反异构酶活性，能够催化蛋白中脯氨酸肽键（Xaa-Pro）的顺反异构化，在蛋白折叠或构象变化中能够加速含脯氨酸蛋白的折叠[22， 23]。CyPD的另一特征是能够与其抑制剂CsA特异性结合，从而使后者具有高效的免疫抑制性能[24，25]。研究表明，CsA与CyPD结合后能抑制CyPD顺反异构酶的活性，从而抑制MPTP开放[26]。以CsA作抑制剂，探索CyPD功能缺失情况下MPTP的开放情况，可作为下一步研究的方向。
MPTP是多种蛋白质组成的蛋白复合体，参与了线粒体介导的细胞凋亡，而MPTP各组分间的相互作用在此过程中发挥了重要作用。PiC和ANT均已经被证明在MPTP的结构构成和功能代谢上具有重要作用[27-29]，研究表明在小鼠中CyPD能通过与ANT结合或者通过促进钙离子触发的PiC变构而促进MPTP开放[30，31]，但尚不清楚植物中CyPD是否能与PiC及ANT发生相互作用。
作為MPTP的重要组成成分，CyPD具有重要的研究价值。本试验以肥城桃为材料对CyPD的结构和功能进行了初步探讨，并取得了一定的进展，为深入了解CyPD在MPTP开放乃至在线粒体介导的细胞凋亡中的作用奠定理论基础。
参考文献：
[1] Chaban Y， Boekema E J， Dudkina N V. Structures of mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and mechanisms for their stabilisation[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA） - Bioenergetics， 2014， 1837（4）： 418-426.
[2]Glancy B， Willis W T， Chess D J， et al. Effect of calcium on the oxidative phosphorylation cascade in skeletal muscle mitochondria[J]. Biochemistry， 2013， 52（16）： 2793-2809.
[3]Kiss G， Koad C， Pour-Ghaz I， et al. Mitochondrial diaphorases as NAD+ donors to segments of the citric acid cycle that support substrate-level phosphorylation yielding ATP during respiratory inhibition[J]. FASEB Journal， 2014， 28（4）： 1682-1697.
[4]Lee J， Giordano S， Zhang J. Autophagy， mitochondria and oxidative stress： cross-talk and redox signalling[J]. The Biochemical Journal， 2012， 441（2）： 523-540.
[5]Nunes-Nesi A， Araújo W L， Obata T， et al. Regulation of the mitochondrial tricarboxylic acid cycle[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2013， 16（3）： 335-343.
[6]Chu C T， Baylr H， Kagan V E. LC3 binds externalized cardiolipin on injured mitochondria to signal mitophagy in neurons[J]. Autophagy， 2014， 10（2）： 376-378.
[7]Bai X， Yan Y， Canfield S， et al. Ketamine enhances human neural stem cell proliferation and induces neuronal apoptosis via reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway[J]. Anesthesia and Analgesia， 2013， 116（4）： 869-880.
[8]Cheng Z， Ristow M. Mitochondria and metabolic homeostasis[J]. Antioxidants & Redox Signaling， 2013， 19（3）： 240-242.
[9]Sinha K， Das J， Pal P B， et al. Oxidative stress： the mitochondria-dependent and mitochondria-independent pathways of apoptosis[J]. Archives of Toxicology， 2013， 87（7）：1157-1180.
[10]Reed J C. Roles of apoptosis-regulating Bcl-2 family genes in AML[M]//Andreeff M （Ed.）. Targeted Therapy of Acute Myeloid Leukemia， New York： Springer， 2015： 47-65.
[11]Wang R， Ma L， Weng D， et al. Gallic acid induces apoptosis and enhances the anticancer effects of cisplatin in human small cell lung cancer H446 cell line via the ROS-dependent mitochondrial apoptotic pathway[J]. Oncol. Rep.， 2016， 35（5）： 3075-3083.
[12]Kumar N， Raj V P， Jayshree B S， et al. Elucidation of structure-activity relationship of 2-quinolone derivatives and exploration of their antitumor potential through Bax-induced apoptotic pathway[J]. Chem. Biol. Drug Des.， 2012， 80（2）： 291-299.
[13]Yee C， Yang W， Hekimi S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C.elegans[J]. Cell， 2014， 157（4）： 897-909.
[14]Bernardi P， Rasola A， Forte M， et al. The mitochondrial permeability transition pore： channel formation by F-ATP synthase， integration in signal transduction， and role in pathophysiology[J]. Physiological Reviews， 2015， 95（4）： 1111-1155.
[15]Kinnally K W， Peixoto P M， Ryu S-Y， et al. Is mPTP the gatekeeper for necrosis， apoptosis， or both？[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA） - Molecular Cell Research， 2011， 1813（4）： 616-622.
[16]Richardson A P， Halestrap A P. Quantification of active mitochondrial permeability transition pores using GNX-4975 inhibitor titrations provides insights into molecular identity[J]. Biochemical Journal， 2016， 473（9）： 1129-1140.
[17]Andreeva L， Heads R， Green C J. Cyclophilins and their possible role in the stress response[J]. Int. J. Exp. Pathol.， 1999， 80（6）： 305-315.
[18]Tsujimoto Y， Shimizu S. Role of the mitochondrial membrane permeability transition in cell death[J]. Apoptosis， 2007， 12（5）： 835-840.
[19]Waldmeier P C， Zimmermann K， Qian T， et al. Cyclophilin D as a drug target[J]. Curr. Med. Chem.， 2003， 10（16）： 1485-1506.
[20]Lemasters J J， Qian T， He L， et al. Role of mitochondrial inner membrane permeabilization in necrotic cell death， apoptosis， and autophagy[J]. Antioxidants & Redox Signaling， 2002， 4（5）： 769-781.
[21]陳长宝， 朱树华， 周杰. 改良 CTAB 法提取成熟肥城桃果实的总RNA[J]. 山东农业科学， 2009（5）： 102-104.
[22]Bernardi P， Di Lisa F. The mitochondrial permeability transition pore： molecular nature and role as a target in cardioprotection[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology， 2015， 78： 100-106.
[23]Itani H A， Dikalova A E， McMaster W G， et al. Mitochondrial cyclophilin D in vascular oxidative stress and hypertension[J]. Hypertension， 2016， 67（6）： 1218-1227.
[24]Wang S， Wei A C， Fu Z， et al. Cyclophilin D binds to Tufm and suppresses mitochondrial translation[J]. Circulation， 2014， 130（Suppl 2）： 274-280.
[25]Gineste C， Hernandez A， Ivarsson N， et al. Cyclophilin D， a target for counteracting skeletal muscle dysfunction in mitochondrial myopathy[J]. Hum. Mol. Genet.， 2015， 24（23）： 6580-6587.
[26]Javadov S， Kuznetsov A. Mitochondrial permeability transition and cell death： the role of cyclophilin D[J]. Front Physiol.， 2013， 4： 76.
[27]Zhu W， Miao Q， Sun D， et al. The mitochondrial phosphate transporters modulate plant responses to salt stress via affecting ATP and gibberellin metabolism in Arabidopsis thaliana[J]. PLoS ONE， 2012， 7（8）： e43530.
[28]Qiu Y， Yu T， Wang W， et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore （mPTP） opening[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2014， 448（1）： 15-21.
[29]Kwong J Q， Molkentin J D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart[J]. Cell Metabolism， 2015， 21（2）： 206-214.
[30]Itoh T， Kouzu H， Miki T， et al. Cytoprotective regulation of the mitochondrial permeability transition pore is impaired in type 2 diabetic Goto–Kakizaki rat hearts[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology， 2012， 53（6）： 870-879.
[31]Leung A W C， Varanyuwatana P， Halestrap A P. The mitochondrial phosphate carrier interacts with cyclophilin D and may play a key role in the permeability transition[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2008， 283（39）： 26312-26323.
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