摘要 通过PCR从黑曲霉（Aspergillus niger）WY49基因组中扩增出植酸酶phy A基因，将其转入毕赤酵母GS-115中，整合到酵母染色体上进行诱导表达，并对表达条件进行了优化。利用蛋白质分离纯化技术纯化重组酶并进行SDS-PAGE，结果表明，蛋白质分子量约为61kDa。植酸酶基因表达产物的理论值为50kDa，说明该植酸酶在酵母中有一定程度的糖基化。最后测定了表达产物的酶学性质，结果表明，表达产物的最适pH值为5.5，最適温度为55℃，且具有良好的pH值稳定性和热稳定性。
关键词 黑曲霉；植酸酶；毕赤酵母GS-115
中图分类号 Q785文献标识码A文章编号1007-5739（2008）13-0255-03
植酸（Phytic Acid or Inositol Hexakis-phosphate）是维生素B族的一种肌醇六磷酸，植酸及其盐类广泛存在于植物组织和粮食产品中，占其总量的3％左右，其中磷含量占植物总磷的70％～90％。但是植酸形式的磷不能被单胃动物所消化利用，而且抑制多种营养成分的吸收和利用。
植酸酶可以分解植酸，变为可以吸收利用的磷元素。但由于天然植酸酶菌株产酶水平较低，不能满足商业化需求，一般是用天然菌株采用基因工程技术手段进行改造获得基因工程菌，提高酶产量。王红宁[1]等提取出了黑曲霉N25的基因组DNA，采用聚合酶Advangage?蛳HF扩增到去除信号肽的内含子后约1.4kb片段，构建pPIC9k?蛳phyA载体，经G418抗性筛选获得了高效表达的转化子并具有良好的遗传性。贝锦龙等[2]将人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶酶基因导入毕赤酵母表达系统，成功表达了植酸酶。2003年，熊爱生等[3]将化学合成的植酸酶基因连接在含有不同分泌信号序列表达载体上，导入Pichia pastoris中，研究了不同的信号序列对Pichia pastoris表达外源植酸酶的影响。
本试验克隆了黑曲霉WY49的植酸酶基因，并研究其在毕赤酵母GS?蛳115中的表达，纯化重组酶并研究其性质，以期获得有商业生产能力的基因工程植酸酶。
1材料与方法
1.1试验材料
黑曲霉WY49和大肠杆菌JM109为实验室保存。毕赤酵母（Pichia pastoris）GS?蛳115以及穿梭载体pPIC9K为Invitrogen公司产品。限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaKaRa TaqTM聚合酶和DNA分子量标准DL2000、DL15000均购自大连宝生物工程有限公司。
1.2试验方法
1.2.1黑曲霉细胞总DNA的提取。利用氯化苄法提取基因组DNA，结合酚/氧仿抽提去除蛋白质等杂质[4]。
1.2.2黑曲霉植酸酶phy A的PCR扩增。从GenBank中下载黑曲霉植酸酶phy A基因序列设计PCR引物[5]，在上下游引物中分别引人EcoR I和Not l酶切位点。设计的引物由华大基因公司合成，上游引物为：5′?蛳GCGAATTCCTGGGA GTCTCCGCTTC?蛳3′，下游引物为：5′?蛳GGGCGGCCGCCTA AGCAGAACACTCC?蛳3′。采用常规方法进行克隆。
1.2.3酵母转化。将携带黑曲霉WY49植酸酶A基因的重组载体pPIC9K?蛳phyA用SacⅠ酶切后得到携带phy A的线性表达载体，准备电击转化，转化方法见参考文献[6]中酵母的转化。电击完毕后，加入1mL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL的EP管中；将菌体悬液涂布于MD平板上，每200～600μL涂布1块平板；将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。
1.2.4重组酵母的诱导和表达。重组酵母接入250mL BMGY培养基中，30℃摇床培养36h，离心收集菌体然后用无菌水洗涤；在转移入100mL的BMGY培养基中，30℃继续培养60h。每隔24h添加大约10g/L的甲醇1mL，以促使其诱导表达。
1.2.5重组植酸酶的纯化和SDS?蛳PAGE的鉴定。植酸酶的活性测定方法参照文献进行[7]，酶的活性单位定义为：在37℃，pH值为5.5条件下每分钟水解植酸释放1μmoL的无机磷所需要的酶量为1个酶活力单位。将纯化后的植酸酶用10% SDS?蛳PAGE进行分析。
1.2.6重组植酸酶酶学性质的测定。分别在不同pH值与温度条件下，测定纯化后的植酸酶活性，绘制植酸酶活性的pH值曲线与温度曲线。
2结果与分析
2.1phy A基因PCR扩增结果
从图1可以看出，在此PCR反应条件下，获得了1条长约1.6 kb的特异性PCR扩增条带，与phy A基因预期长度一致（如图1）。
2.2phy A基因的克隆及重组质粒的鉴定
PCR产物胶回收后，用EcoR I和Not I双酶切并纯化，以适当比例与同样双酶切的pPIC9K连接，并转化大肠杆菌后，在Amp抗性平板上得到转化子。表达质粒转入大肠杆菌后，挑取单克隆并进行PCR验证可得到1条1.6kb左右的片段（见图2a），与预期片段大小一致。同时用限制性内切酶EcoR I和Not l对重组质粒进行双酶切鉴定（见图2b），结果表明植酸酶基因成功克隆。
2.3重组酵母的转化和筛选鉴定
提取大肠杆菌质粒，用SacⅠ线性化后，电击转化酵母GS?蛳115，通过MD平板和抗性筛选得到转化子。然后提取基因组DNA分别用上述相应引物进行PCR验证。将阳性菌株进行酶活力检测，得到一株产酶活性为106.32 U/mL的基因工程菌。
2.4重组酵母诱导表达条件的优化
每24 h补加甲醇使其在培养基中的终浓度分别为5g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30g/L，诱导培养3d，结果见图3。从图3可以看出，在甲醇浓度为10 g/L时毕赤酵母表达的植酸酶活性最高。
2.5重组植酸酶的纯化和SDS-PAGE的鉴定
将诱导培养60h后的菌株离心收集培养液，经饱和硫酸铵的分级沉淀、超滤和阴离子交换层析3个步骤后，发酵液里的植酸酶得以纯化。SDS?蛳PAGE分析表明，纯化后植酸酶约为1条61kDa的条带，比理论值50kDa[8]偏大，说明该酶有一定程度的糖基化（见图4）。
2.6重组植酸酶酶学性质的测定
2.6.1最适pH值。通过对植酸酶在pH值2～8范围内酶活力的测定，发现毕赤酵母GS?蛳115表达的植酸酶在pH值为3时有1个活力峰，在pH值为5.5酶活最高（见图5）。
2.6.2最适温度。在30～80℃之间测定植酸酶的活力，说明重组酵母表达的植酸酶最适温度为55℃（见图6）。
2.6.3酶的pH值稳定性。在55℃，分别在pH值5.5、6.0、6.5条件下每隔10min测定酶活力。结果表明，在pH值5.5下反应50min，残余酶活为86.21%，100min后残余酶活为78.5%；pH值6.0下保温50min，残余酶活为73.6%，保温100min，残余酶活为55.34%；pH值6.5下保温50min，残余酶活为63.81%，保温100min，残余酶活仍有44.9%（见图7）。这说明此酶具有较好的pH值稳定性。
2.6.4酶的热稳定性。在pH值5.5条件下，分别在55℃、60℃和65℃按上述每隔10min测定植酸酶活力，结果表明，在55℃下保温30min，酶活性基本无损失，100min残余酶活为78.52%；60℃下保溫30min，残余酶活为87.46%，保温100min，残余酶活为64.1%；65℃下保温30min，残余酶活为37.38%，保温100min，酶活性则完全丧失（见图8）。
3讨论
目前，植酸酶已经可以用于动物喂养，但是在饲料工业中尚未能得到广泛的应用，因为植酸酶产生菌的表达量低，所以构建含植酸酶基因的高产基因工程菌株成为植酸酶研究的热点。而毕赤酵母具有蛋白表达量高，并且能进行蛋白翻译后修饰，生产成本低，是理想的高效真核表达系统。本试验将实验室保存的黑曲霉WY49的植酸酶基因插入到毕赤酵母GS?蛳115的染色体DNA上进行表达，测得表达产物植酸酶的酶活力为106.32U/mL，并对表达产物进行纯化鉴定，所测得的酶学性质与理论值基本相符。上述结果说明，毕赤酵母GS?蛳115能够作为黑曲霉WY49菌株植酸酶的高效表达菌株。但这与工业化生产的要求还有一定距离，需对植酸酶基因进行定点改造和突变，以进一步提高植酸酶的表达量。
此外，因为在单胃动物中pH值约为1.5～4.0，肠道pH值为5.0～7.0，所以若要以植酸酶作为饲料添加剂，要求其在酸性环境中有较高的酶活力。试验中重组酵母表达的植酸酶最适pH值分别为2.5～3.5和5.0～6.0，在pH值4.5～6.0之间酶活力较高，这个结果说明植酸酶在酸性环境中的活力较高，pH值适用范围显著加宽，发生这样的改变可能是因为在酵母中蛋白质所连接的糖链及其分泌途径与在黑曲霉中不同。
4参考文献
[1] 王红宁，吴琦，谢晶，等.真菌植酸酶phyA基因研究进展[J].四川农业大学学报，2000，18（1）：84-87.
[2] 贝锦龙，陈庄，杨林，等.人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶在毕赤酵母中高效表达[J].生物工程学报，2001，6（3）：254-258.
[3] 熊爱生，彭日荷，李贤，等.信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响[J].生物化学与生物物理学报，2003，35（2）：154-160.
[4] 张莉莉，张苓花，史剑斐，等.利用氯化卞提取真菌基因组DNA及其分子生物学分析[J].大连轻工业学院学报，2000，19（1）：36.
[5] 王红宁，吴琦，刘世贵，等.黑曲霉N25植酸酶phyA基因的克隆及序列分析[J].微生物学报，2001，41（3）：310.
[6] 康伟，王智，詹冬玲，等.黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母GS-155系统中的表达[J].吉林农业大学学报，2006，28（6）：623-627.
[7] 张若寒.植酸酶活性的检测方法[J].中国饲料，1997，13（5）：30-32.
[8] VAN HARTINGSVELDT M，VAN ZEIJI C M J，HARTEVELD G M，et al.Cloning，characterization and overexpression of the Phytase encoding gene（phy A）of Aapergillus niger [J].Gene，1993（127）：87-94.
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