[摘要] 目的 探讨槐角染料木素对哮喘小鼠白介素-5（IL-5）、白介素-13（IL-13）含量的影响。 方法 32只BALB/c雌性小鼠随机分为对照组（n=10）、模型组（n=11）和干预组（n=11）。模型组和干预组采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）腹腔注射致敏和雾化吸入激发，建立哮喘小鼠模型。干预组于激发前腹腔注射染料木素30 mg/kg。观察小鼠哮喘症状的发生情况，检测小鼠血清OVA特异性IgE水平。检测肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）计数及其分类比值和细胞因子IL-5、IL-13含量。 结果 与模型组相比，干预组小鼠哮喘症状出现较迟，且症状较轻微。与对照组相比，模型组BALF中EOS计数及分类比值、IL-5和IL-13的含量及血清中OVA特异性IgE水平均明显增加（均P < 0.01）。与模型组相比，干预组BALF中EOS计数及分类比值、IL-5和IL-13的含量及血清中OVA特异性IgE水平均明显降低（均P < 0.01）。 结论 染料木素可缓解小鼠哮喘症状，可能与其降低哮喘小鼠IgE水平，降低IL-5及IL-13的含量，从而减轻气道炎症有关。
[关键词] 染料木素；哮喘；小鼠；白介素-5；白介素-13
[中图分类号] R562.25 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（b）-0012-04
[Abstract] Objective To investigate the effect of genistein of fructus sophorae on the contents of interleukin-5 （IL-5） and interleukin-13 （IL-13） in mice with asthma. Methods 32 BALB/c female mice were divided into the control group （n=10）， model group （n=11） and intervention group （n=11） randomly. Model group and intervention group were sensitized by intraperitoneal injection with ovalbumin （OVA） and excited by aerosol inhalation with OVA. The intervention group was given intraperitoneal injection with 30 mg/kg genistein before excitation. The asthma symptoms of mice were observed. The serum levels of anti-OVA IgE， the counts and classification ratios of eosinophils （EOS）， the contents of IL-5 and IL-13 in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were detected. Results Compared with the model group， the asthma symptoms of the intervention group were appeared late and mildly. Compared with the control group， the counts and classification ratios of EOS， the contents of IL-5 and IL-13 in BALF， the serum levels of anti-OVA IgE in the model group were significantly increased （all P < 0.01）. Compared with the model group， the counts and classification ratios of EOS， the contents of IL-5 and IL-13 in BALF， the serum levels of anti-OVA IgE in the intervention group were reduced significantly （all P < 0.01）. Conclusion Genistein can relieve the symptoms of asthma， may concern with it"s reduction the levels of IgE， the contents of IL-5 and IL-13， and inhibition airway inflammation.
[Key words] Genistein； Asthma； Mice； Interleukin-5； Interleukin-13
支气管哮喘（简称“哮喘”）是一种全球性多发病、常见病，各国患病率不等，其发病机制十分复杂，气道慢性炎症被认为是哮喘的本质[1]。Th1/Th2细胞亚群功能失衡及T细胞所分泌的细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-21等功能紊乱是哮喘发病的重要基础[2-5]。染料木素也称染料木黄酮、金雀异黄酮，为特异性蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）抑制剂，在生物体内具有抗肿瘤、抗氧化、拮抗雌激素等生物学活性[6-7]。目前染料木素对呼吸系统疾病影响的研究主要集中在肺癌、肺纤维化及肺动脉高压防治方面，而对哮喘防治的研究较少[8-10]。本研究旨在通过复制哮喘小鼠模型，观察IL-5和IL-13在哮喘发生发展过程中的变化，并探讨槐角染料木素对哮喘小鼠IL-5、IL-13的调控作用，初步了解染料木素控制哮喘的作用机制，为染料木素治疗哮喘提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
JJ200电子秤，YLS-8A多功能诱咳引喘仪，Sysmex-XT 2000i全血细胞分析仪，Luminex200液相芯片分析系统，美国Bio-TEK ELx 508自动洗板机，美国Model 680伯乐酶标仪。
1.2 主要试剂
染料木素（大连美仑生物技术有限公司），卵清清蛋白OVA（Sigma，SLBB4340V），白细胞分类染液（Sysmex，A5005），血红蛋白溶血素（Sysmex，A5005），嗜碱细胞溶血素（Sysmex，R5036），白细胞溶血素（Sysmex，R5019），PK-30L CELLPACK稀释液（Sysmex，G5248），Mouse IL-5 simplex（eBioscience，117633009），Mouse IL-13 simplex（eBioscience，115826007），抗-OVA IgE试剂盒（eBioscience，102715）。
1.3 实验动物及饲养
6～8周SPF级BALB/c雌性小鼠32只，购自广东省医学实验动物中心，质量合格证：No.44007200022603。按照广东省动物实验监测所啮齿类接收、适应及检疫操作规程（VET-003）和实验动物饲料、垫料和饮水的质量控制操作规程（LA-ADM006，LA-ADM007，LA-ADM008）操作。动物饲养于屏障动物实验室，实验动物使用许可证编号：SYXK（粤）2012-0122，IACUC审批编号：2015015。每日室温控制为20～26℃，湿度控制为40%～70%。SPF级鼠饲料购自北京科澳协力饲料有限公司，饮用消毒纯水，每日足量供给。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 32只小鼠随机分为对照组（10只）、哮喘模型组（简称“模型组”，11只）及染料木素给药干预组（简称“干预组”，11只）。
1.4.2 动物致敏 模型组和干预组分别于第1、15天致敏，每次每只小鼠腹腔注射致敏液0.2 mL（OVA溶液的配制：OVA 10 mg加生理盐水10 mL，氢氧化铝40 mg加生理盐水10 mL，两者等体积混匀，0.22 μm滤器过滤）。对照组于相同时间腹腔注射等量生理盐水。
1.4.3 动物激发 模型组和干预组小鼠于实验第22天起，每日雾化吸入5% OVA激发液，每次30 min，连续14 d。干预组并于每次雾化前30 min给予腹腔内注射染料木素30 mg/kg。对照组于相同时间雾化吸入等量生理盐水。
1.5 观察指标
1.5.1 哮喘症状观察 观察各组小鼠每次激发后症状及体征变化，如精神状态、呼吸频率、大小便失禁及抽搐等情况。并参照王力宁等[11]的方法，对小鼠哮喘症状进行评分，分值越高表示哮喘症状越重。见表1。
1.5.2 血清中Anti-OVA IgE水平检测 小鼠摘眼球取血200 μL，离心后取血清，用ELISA法检测Anti-OVA IgE水平，操作严格按说明书进行。
1.5.3 支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞计数及其分类比值分析和IL-5、IL-13含量检测 小鼠处死后，行气管插管，在右主支气管处结扎右肺，用0.3 mL冰PBS分3次灌洗左肺并回收支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），采用Sysmex-XT2000i全血细胞分析仪分析BALF中嗜酸性粒细胞（eosinophil，EOS）计数及其分类比值，Luminex200检测BALF中IL-5、IL-13的含量。
1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-Q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 哮喘症状观察
对照组小鼠整个激发过程呼吸平顺，活动正常，无大小便失禁及烦躁不安现象。模型组小鼠在激发第5天起，出现呼吸深快、鼻翼煽动、烦躁不安、大小便失禁现象。干预组小鼠在激发第7天出现呼吸深快、烦躁不安现象，但症状较模型组相对较轻，未出现大小便失禁现象。三组小鼠均未出现抽搐现象。三组小鼠哮喘症状评分比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与对照组比较，模型组及干预组小数哮喘症状评分均升高（P < 0.01），干预组评分低于模型组（P < 0.01）。见表2。
2.2 三组小鼠BALF中EOS计数及分类比值比较
三组小鼠BALF中EOS计数及分类比值比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与对照组相比，模型组和干预组小鼠BALF中EOS计数及分类比值均明显升高，差异有高度统计学意义（均P < 0.01）；与模型组相比，干预组小鼠BALF中EOS计数及分类比值均明显降低，差异有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表3。
2.3 三组小鼠血清中Anti-OVA IgE水平比较
三组小鼠血清中Anti-OVA IgE水平比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；对照组血清中Anti-OVA IgE水平最低，干预组次之，分别为（14.161±2.266）ng/mL和（128.414±45.608）ng/mL，模型组小鼠血清中Anti-OVA IgE水平为（315.225±71.167）ng/mL，显著高于对照组和干预组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；而干预组血清中IgE水平亦显著高于对照组（P < 0.01）。
2.4 三组小鼠BALF中IL-5、IL-13含量比较
三组小鼠BALF中IL-5、IL-13含量比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；模型组和干预组BALF中IL-5及IL-13含量均较对照组升高，差异有高度统计学意义（均P < 0.01）；干预组BALF中IL-5及IL-13含量均较模型组降低，差异有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表4。
3 讨论
Th1/Th2细胞功能失调、Th2活化与细胞因子分泌亢进是哮喘发生发展的重要基础[12]。细胞因子是炎症细胞释放的肽类炎性介质，有调控细胞的生长、增殖和分化功能，其中，白细胞介素（interleukin，IL）是重要的一类细胞因子[13]。IL-5是由Azuma等于1986年克隆成功的一种具有多种生物学功能的淋巴因子。IL-5由Th2细胞产生，是一种含有N-乙酰氨基半乳糖残基的弱酸性糖蛋白，分子量为12 300，呈完全疏水性。IL-5可调节嗜酸粒细胞的分化、增殖、启动及活化，并影响其黏附力及细胞受体的表达，对趋化作用及介质的合成也有辅助作用[14]。研究发现，哮喘患者发作期静脉血IL-5水平明显高于对照组及稳定期患者，且与血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子β1水平呈正相关，推测IL-5水平的升高参与细胞外基质的产生，促使炎症细胞浸润，使气道纤维化及气道重构进程加剧，在哮喘的呼吸道炎症及呼吸道重塑中起重要作用[15]。IL-13是近年来新克隆的Th2型细胞因子，可通过募集、归巢、激活炎性细胞介导EOS的聚集，而在哮喘的发生中起重要作用。IL-13还可不依赖于其他Th2型细胞因子及嗜酸粒细胞IgE介导的途径而单独诱发哮喘的所有症状，是哮喘病理发生中的关键细胞因子。IL-13也可增加支气管的高反应性，促进支气管上皮细胞成熟和黏液分泌及细胞外基质的合成，并增强呼吸道平滑肌细胞的收缩力，参与呼吸道炎症与呼吸道重塑过程[16-17]。程静等[18]通过对IL-4、IL-12、IL-13在哮喘小鼠模型致敏和激发不同时期浓度变化中发现，哮喘小鼠BALF中IL-13水平从致敏第5天开始显著增高，随着过敏原继续刺激而呈现不断升高趋势，并伴随炎症细胞在肺部浸润增多，最终导致哮喘的一系列气道病变。
本研究发现，与模型组小鼠相比，给予染料木素的干预组小鼠哮喘症状出现较迟，且症状较轻微。与对照组小鼠相比，模型组小鼠BALF中EOS计数及分类比值明显增加（均P < 0.01），IL-5、IL-13的含量也明显增加（均P < 0.01），血清中OVA特异性IgE水平明显升高（P < 0.01）；染料木素可显著降低哮喘小鼠BALF中EOS计数及分类比值（P < 0.01）和IL-5、IL-13含量（P < 0.01），并明显降低血清中OVA特异性IgE水平（P < 0.01）。
槐角又称槐实，为豆科植物槐（Sophora japonica L.）的果实，有凉血止血、清肝明目的作用。槐角含有多种化学成分，主要为黄酮类化合物，还有三砧皂昔、生物碱、磷脂、氨基酸以及多糖等。槐角染料木素是从槐角中分到的异黄酮，可抑制细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2的磷酸化，抑制肥大细胞的活化，减轻过敏性炎性反应[19]。在食物中增加染料木素可以减轻哮喘患者的症状，提高一秒用力呼气容积，改善患者肺功能，减少哮喘控制不良事件的发生[20]。推测染料木素产品很可能能抑制哮喘的发生和发展，具有乐观的临床开发前景。
综上所述，染料木素可缓解小鼠哮喘症状，可能与其降低哮喘小鼠IgE水平，降低IL-5及IL-13的含量，减轻气道炎症有关，但其具体的机制有待进一步深入研究。
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（收稿日期：2016-04-12 本文编辑：程 铭）
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