[摘要] 目的 探讨L1细胞黏附分子（L1-CAM）在大肠癌中的表达情况及其与临床病理的相关性。 方法 应用实时荧光定量PCR检测浙江省人民医院58例大肠癌组织及其癌旁正常组织中L1-CAM的表达，分析L1-CAM在大肠癌中的表达及其与临床病理学特征和预后的关系。 结果 癌组织和癌旁正常组织L1-CAM mRNA表达差异有统计学意义（P < 0.05）。癌组织L1-CAM mRNA表达与肿瘤分化程度、静脉侵犯、淋巴管侵犯、淋巴结转移、Dukes分期密切相关（均P < 0.05），而与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤类型无明显相关（均P > 0.05）。 结论 L1-CAM在大肠癌组织中高表达，并且与大肠癌的浸润、转移有关。
[关键词] 大肠癌；L1细胞黏附分子；实时荧光定量PCR
[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）09（b）-0092-04
[Abstract] Objective To investigate the L1-CAM mRNA expression in cancerous tissue of patients with colorectal carcinoma and to evaluate the relationship between L1-CAM mRNA expression and clinicopathological significance. Methods Cancerous tissue and para-carcinoma tissue samples were collected from 58 patients with colorectal carcinoma from Zhejiang Provincial People"s Hospital. Real time PCR was used to detect the L1-CAM mRNA expression in cancerous tissue and para-carcinoma tissue， and the relationships between L1-CAM mRNA expression and pathologic parameters were observed. Results The expression of L1-CAM mRNA was significantly higher in cancerous tissue than in para-carcinoma tissue （P < 0.05）. L1-CAM mRNA expression was found to be significantly related with the pathologic parameters， such as depth of differentiation， venous invasion， lymphatic invasion， lymph node metastasis， and clinicopathological stage （Dukes）， with statistically significant differences （P < 0.05）； however， no significant association between L1-CAM mRNA expression and age， sex， tumor size， or the type of tumor were found （all P > 0.05）. Conclusion The high expression of L1-CAM may be related with the devolopment and progression of colorectal cancer.
[Key words] Colorectal carcinoma； L1-CAM； Real time PCR
L1细胞黏附分子（L1 cell adhesion molecules，L1-CAM）是分子量为200～220 kD的免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，是主要介导细胞间及细胞与胞外基质间黏附作用的细胞表面糖蛋白，其胞外域由6个细胞外免疫球蛋白区域、5个纤维连接蛋白区域以及由85～147个氨基酸组成的疏水跨膜细胞质区域组成[1]。研究发现，L1-CAM对中枢神经系统的发育起着关键的作用：最初它是在神经元细胞特别是神经鞘细胞中被发现，促进L1-CAM阳性的神经细胞突起生长，参与细胞间接触、黏附、轴索的迁移、分化成纤维束。L1-CAM主要通过嗜同性和嗜异性两者相结合机制与邻近细胞结合，从而将细胞黏附在一起。
近年来大量研究结果显示，L1-CAM在肿瘤的发生发展中扮演了非常重要的角色。L1-CAM在人类正常组织中表达是缺失的，但在多种人类恶性肿瘤中高表达，如乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌等[2-5]，并在肿瘤的侵袭、转移、上皮间质转化及肿瘤血管生成等一系列过程中起着重要作用。研究显示，L1-CAM常表达于实体肿瘤侵袭边缘，与肿瘤细胞侵袭和转移密切相关[6-8]。因此，本研究采用实时荧光定量PCR方法检测大肠癌患者癌组织与癌旁正常组织L1-CAM mRNA表达的差异，并分析其与临床病理因素之间的关系，为进一步探讨大肠癌发病的机制和诊治研究提供新的思路。
1 对象与方法
1.1 对象
收集2012年1月～2014年12月于浙江省人民医院肛肠外科行大肠癌手术患者的组织标本58例为实验组，另选择癌旁正常组织为对照组。全部病例均经手术和病理检查证实，术前均未接受化疗及放疗。58例患者中，男34例，女24例；年龄35～82岁，中位年龄为56岁；结肠癌23例，直肠癌35例；肿瘤病理组织学类型：黏液腺癌16例，乳头状腺癌9例，管状腺癌33例；大肠癌分期按Dukes法，A期14例，B期20例，C期16例，D期8例。
1.2 仪器与试剂
M-MLV逆转录酶（MBI Fermentas公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），实时荧光PCR仪（德国Roche公司）。
1.3 方法
1.3.1 设计与合成 在GENEBANK查到引物基因序列，使用软件Primer Express 2.0进行设计。L1-CAM基因引物序列：上游5"-GGCACCAAATGGCTGTGAAG-3"；下游3"-CCAAAGGCCTTCTCCTCGTT-5"；产物大小256 bp。内参基因GAPDH引物序列：上游5"-AGAA GGCTGGGGCTCATTTG-3"；下游3"-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-5"；产物大小258 bp。
1.3.2 标本制备 标本采集后迅速放到液氮中冷冻，置于-80℃冰箱保存。
1.3.3 RNA提取和cDNA合成 取50～100 mg组织样本用液氮研磨，加入Trizol中充分裂解后，加0.2 mL氯仿4℃离心15 min，取上清加入500 μL预冷的异丙醇，-20℃沉淀35 min以上，取出后4℃离心10 min，弃去液体加入1 mL 80%乙醇，4℃离心10 min，弃去乙醇后室温下晾干3～5 min，加入50～100 μL Nuclease-free water溶解RNA。用NanoDrop 1000测定RNA浓度。取总RNA 2 μg进行逆转录，按照说明书要求进行cDNA合成，所合成的cDNA置于-20℃冰箱保存。
1.3.4 实时荧光定量PCR L1-CAM mRNA和GAPDH mRNA的反应液组成：Nuclease-free water 5 μL，5×RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，Primer Mix 0.5 μL，RNA 2 μg。PCR反应：反应体系为20 μL，包括SYBG 10 μL，H2O 7.2 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4 μL，上述反应液2 μL。反应条件：95℃变性1 min，95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，共35个循环；熔解曲线反应程序为：65～95℃ 每5秒增加0.5℃。每个样本都做3个复孔。
1.3.5 PCR产物定量的校正和判定分析 采用相对定量法，在测定目的基因的同时测定内参基因GAPDH，用以标准化标本。根据Real time PCR原理，CT值和样本起始拷贝数呈对应关系，CT值越高，起始拷贝数越少，利用CT值就可以计算L1-CAM和GAPDH的比值，即靶基因表达水平=靶基因CT值/内参CT值，以此比值做统计处理。该比值与mRNA实际表达值成反比，即比值越高，实际表达值越低。
1.4 统计学方法
应用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 L1-CAM在大肠癌组织和癌旁正常组织中的表达
大肠癌组织和癌旁正常组织均表达L1-CAM mRNA，其表达水平分别为（0.988±0.486）和（1.412±0.413），大肠癌组织中L1-CAM mRNA表达显著高于癌旁正常组织（P < 0.05）。
2.2 癌组织L1-CAM表达与大肠癌临床病理指标的关系
L1-CAM mRNA表达与大肠癌临床病理指标的关系见表1。从表中可知，L1-CAM表达与分化程度、静脉侵犯、淋巴管侵犯、淋巴结转移、Dukes分期密切相关（均P < 0.05）；而与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤类型无明显相关（均P > 0.05）。该结果表明L1-CAM与大肠癌的浸润、转移密切相关。
3 讨论
L1-CAM细胞黏附分子是细胞黏附分子免疫球蛋白超家族中的重要成员之一。L1-CAM作为Wnt/β-catenin（β-cat）/LEF/TCF信号通路的靶基因，通常在正常人类组织中表达缺失，而当Wnt信号通路组成元件发生突变时，由于β-cat的降解受到抑制，使得胞质聚集并形成β-cat/LEF/TCF复合体，该复合体与L1-CAM基因启动子上的β-cat/LEF/TCF结合位点结合即可促进L1-CAM基因启动子的表达[9-10]。实验证明，采用siRNA干扰肿瘤细胞β-cat的表达后，L1-CAM的表达也相应地明显降低，说明L1-CAM的表达与肿瘤细胞的侵袭和转移具有密切的相关性[11]。事实上，L1-CAM在多种恶性肿瘤组织中均呈高表达，并在肿瘤的侵袭、转移、上皮间质转化及肿瘤血管生成等一系列过程中起着重要作用[12-15]。本研究结果显示，大肠癌患者癌组织L1-CAM mRNA表达强度显著高于癌旁正常组织，说明L1-CAM的过度表达同样与大肠癌的发生发展有密切的关系，大肠癌癌细胞从中度异型增生发展到重度异型增生是一个逐渐演变的过程，这一过程可能是通过自分泌或旁分泌的作用方式促进癌细胞的增殖和发展[16]。
肿瘤的浸润与转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，分析判断肿瘤细胞的浸润和淋巴转移对评估患者预后及复发密切相关[16-18]。Gavert等[19]将L1-CAM呈阳性表达的结肠癌LS174T细胞系中加入去整合素样金属蛋白酶10水解L1-CAM，其可溶性片段通过尾静脉注射到成瘤小鼠体内，研究结果证实，L1-CAM可促进肿瘤细胞发生肝脏转移。Kajiwara等[20]采用逆转录PCR研究发现，侵袭边缘的L1-CAM mRNA表达水平显著高于中心区域的癌细胞，并且与淋巴结转移密切相关，该结果提示L1-CAM表达与结肠癌的恶性程度密切相关。本研究表明，随着大肠癌临床病理分期的升高，L1-CAM mRNA表达明显上升，大肠癌Dukes C、D期L1-CAM的表达明显高于A、B期（P < 0.05）。癌组织中L1-CAM mRNA的表达在不同分化程度、静脉侵犯、淋巴管侵犯、淋巴结转移、Dukes分期的肿瘤组织具有显著性差异。L1-CAM在有转移、复发倾向的大肠癌组织中表达明显高于无转移、复发的大肠癌组织，这表明L1-CAM表达越高，大肠癌的增殖活性就越强，其浸润、转移的可能性也就越大。研究结果提示L1-CAM参与大肠癌的浸润和转移。
综上所述，L1-CAM的表达是一个对临床评估大肠癌预后非常有意义的参考指标，可为临床评估预后、判定复发提供客观科学的理论依据。目前针对L1-CAM的抗体正在研究之中，其有望成为临床上大肠癌化学药物治疗的新靶点[21-26]。
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（收稿日期：2016-06-02 本文编辑：程 铭）
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