材料与方法
1.1供试材料
藜草花叶病毒（SoMV）、番茄黑环病毒（TBRV）、草莓潜环斑病毒（SLRSV）、番茄丛矮病毒（TBSV）和桃丛簇花叶病毒（PRMV）由中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所提供。
1.2仪器设备
实时荧光PCR仪ABI 7000（美国，应用生物公司）;PCR扩增仪PTC-200（美国，MJ公司）;纯水仪Milli-Q（美国，Millipore）;高压灭菌锅MLS 3020（日本，SANYO）;高速冷冻离心机5417R（德国，Eppendorf）;涡旋振荡器MS1 minishaker（美国，IKA）;金属浴ALB 128（美国，Thermo）;多用电泳系统PROTEAN II（美国，BIO-RAD）;凝胶成像系统Universal HoodⅡ（美国，BIO-RAD）;核酸蛋白分析仪Bio Photometer（德国，eppendorf）。
1.3试剂
植物总RNA提取试剂盒（DP432）购自天根生化科技（北京）有限公司;反转录试剂盒（货号：RR037A）购自TaKaRa公司;实时荧光PCR试剂盒Platinum购自Invitrogen公司等。
1.4TaqMAN探针与引物的设计与合成
根据NCBI数据库中藜草花叶病毒全基因组中多聚蛋白质基因序列保守区，分别设计2套TaqMAN探针和引物，探针5′端发光基团为FAM，3′端淬灭基团为TAMRA，引物和探针由上海生工合成。
该研究共设计了3条引物和1条探针，其中引物包括1条上游引物和2条下游引物，上游引物SoMVF：5′-CCGATGGAACACTTATTCAACAGT-3′。下游引物用SoMVR表示，其中SoMVR1：5′- TGGAGTTGGTGGAGGAAGTACA-3′;SoMVR2：5′-GCCATAAGGCAGCGGACTC-3′。探针SoMVP：5′-FAM-TCGCCGGGTGTTATGAAGTCAGGATC-TAMARA-3′;PCR产物长度SoMVF/SoMVR1为78 bp，SoMVF/SoMVR2为97 bp。3条引物及探针组成2套不同的反应组合，套1为SoMVF/SoMVR1/SoMVP，套2为SoMVF/SoMVR2/SoMVP。
1.5病毒核酸提取与质量控制采用试剂盒提取病毒叶片及健康叶片（CK）中总RNA，操作步骤详见试剂盒DP432说明书。提取的核酸用核酸蛋白分析仪测定浓度与纯度值，确保核酸质量。
1.6cDNA合成
病毒总RNA及水对照CK采用反转录试剂盒在PTC-200 普通PCR扩增仪上分别进行反转录过程合成cDNA。反应体系：5×Primer Script Buffer 2.0 μL，oligo dT Primer（50 μmol/L） 0.5 μL，Primer ScriptRT Enzyme Mix I 0.5 μL，Random 6 mers（100 μmol/L）0.5 μL，总RNA 2.0 μL，加DEPC水至10.0 μL。反转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。
1.7实时荧光PCR检测
1.7.1特异性检测。
以上述不同病毒的cDNA及2种阴性对照为模板，在实时荧光PCR仪96孔板中进行半巢式实时荧光PCR特异性检测。反应体系：2×PCR buffer 12.5 μL，上游引物（15 μmol/L）1.0 μL，下游引物（15 μmol/L）1.0 μL，探针（10 μmol/L）1.0 μL，ROX 0.5 μL， cDNA 2.0 μL，加ddH2O至25.0 μL。反應条件：50 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45 cycles。
1.7.2灵敏度检测。
将提取的藜草花叶病毒总RNA，用ddH2O从10-1稀释到10-10及ddH2O共11个梯度，分别按照“1.6”中的反应体系和反应条件进行cDNA合成，然后进行半巢式实时荧光PCR灵敏度检测，反应体系和反应条件同“1.7.1”。
1.7.3扩增效率对比试验。
采用藜草花叶病毒同一cDNA为模板，分别用2套引物-探针进行半巢式实时荧光PCR检测，以比较这2套引物探针的扩增效率。实时荧光PCR操作同“1.7.1”。
2结果与分析
2.1特异性检测结果
套1（SoMVF/SoMVR1/SoMVP）和套2（SoMVF/SoMVR2/SoMVP）结果分别见图1、2。结果显示，2套引物探针分别只有在SoMV的cDNA为模板的反应中出现扩增曲线，其他4种病毒和2种阴性对照cDNA均未出现扩增信号，说明2套引物探针的特异性很好，符合预期。
2.2灵敏度检测结果
该试验中所提取RNA浓度与纯度值为39.8（约为40）ng/μL，核算蛋白分析仪测定结果为OD260/280=2.16，OD260/230=2.33。稀释后各个梯度所对应的RNA浓度从4 ng/μL～0.004 fg/μL及ddH2O。反转录分别合成cDNA后，进行半巢式实时荧光PCR扩增。套1、套2结果分别见图3、图4。荧光PCR扩增的结果表明，当RNA稀释至10-9（即0.04 fg/μL）时，检测不到信号，因此该方法检测的灵敏度可达10-8，即0.4 fg/μL植物总RNA。
2.3扩增效率对比试验结果
套1组合（SoMVF/SoMV R1/SoMV P）和套2组合（SoMVF/SoMVR2/SoMV P）引物探针的扩增效率结果对比见图5。由图5可见，2套引物探针的扩增效率几乎等同。
3结论与讨论
近年来，随着国际贸易的发展，进口植物种苗批次和货值急剧增加，进口植物种苗口岸呈现集中化与专一化特点，各个种苗口岸截获了大量的植物疫情，特别是检疫性的植物病毒。进境种苗中植物病毒的检测一直是我国检验检疫系统的重点难点，絕大多数的口岸局都没有掌握植物病毒室内的检测技术，很多都还停留在初步判断阶段[10]，如果要鉴定到种，往往需要送到鉴定能力强的省局实验室进行鉴定，费时费力。特别是其中木本植物中病毒的检测，由于它们在植株体内含量低、分布不均，且时有复合侵染等特殊性，传统的方法，极易出现漏检和误检[11]，藜草花叶病毒就是其中之一。SoMV侵染症状常常表现较轻或无症状，且在一些寄主
上， 病毒含量很低，导致生物学检测或血清学检测较为困难[1]。
使用不同的方法，其检测灵敏度差异较大[11]。为了确认结果的正确性，经常需要对一个结果进行另一种方法的确认试验，例如通过RT-PCR方法检出一种病毒，往往需要通过ELISA方法进行确认，但是ELISA方法检测灵敏度较低，有可能导致漏检，这就为结果的判断增加了难度，尤其是在检测目标含量极少的情况下，极易造成结果判断错误。但如果方法之间检测灵敏度相近的话，漏检问题就迎刃而解，很少造成漏检情况。
基于上述原因，笔者建立了半巢式RT-Realtime PCR检测藜草花叶病毒的方法。该方法充分利用了实时荧光PCR方法所固有的特异性强、可重复性好、定量分析较准确、PCR污染少、自动化程度高等特点[12]，同时巧妙地将巢式PCR的原理，运用到实时荧光PCR技术中[11，13]。设计上仅仅在一般实时荧光PCR的基础上增设了一条引物，就形成了2套完全独立的检测体系，2套引物探针相互印证，可以减少假阳性的出现，又进一步提高了准确性。这2套引物探针的扩增效率极高且近乎等同，这样就避免了藜草花叶病毒漏检情况的出现。与单一的巢式PCR或Realtime PCR等方法相比，其检测的准确性、灵敏度更高，同时也解决了由于灵敏度不同导致结果漏检的问题。该试验结果表明，方法检测的灵敏度可达0.4 fg/μL植物总RNA。
安徽农业科学2019年
参考文献
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