【摘要】 目的 研究吲哚美辛对β淀粉样蛋白1—42（Aβ1—42）刺激小胶质细胞释放炎性介质一氧化氮(NO)及白细胞介素—1β（IL—1β）的抑制作用。方法 应用高度纯化的BV—2小胶质细胞作为体外小胶质细胞模型，应用不同浓度吲哚美辛（10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L）与20μmol/L Aβ1—42单独或同时培养12h，测定细胞上清NO及IL—1β含量；RT—PCR法测定BV—2细胞iNOS mRNA及IL—1β mRNA的表达。结果 吲哚美辛单独作用对BV—2细胞产生NO、IL—1β及iNOS mRNA、IL—1β mRNA表达无明显作用。Aβ1—42可以刺激BV—2细胞产生NO及IL—1β，并增加iNOS mRNA及IL—1β mRNA表达，这种作用均可被吲哚美辛所抑制，在吲哚美辛浓度为10-7—10-5mol/L时抑制作用较为明显。
结论 在体外吲哚美辛可以降低Aβ1—42介导的BV—2细胞iNOS mRNA及IL—1β mRNA表达，从而减少NO及IL—1β的产生，上述抑制作用可能参与了吲哚美辛在阿尔茨海默病治疗中的神经元保护机制。
【关键词】 吲哚美辛；淀粉样β蛋白；炎症;小神经胶质细胞；一氧化氮；白细胞介素1β
炎症免疫机制在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的发生发展中具有十分重要的作用。流行病学以及临床研究表明,长期应用抗炎药物可以延缓AD的发病并缓解症状，脑的特异性抗炎药的研发已成为AD治疗的一个研究热点。非甾体类抗炎药（nonsteroidal anti—inflammatory drugs，NSAIDs）的代表药物吲哚美辛（indomethacin）可延缓AD病程，长期服用吲哚美辛的患者AD发病的危险性明显降低［1］。但目前该药延缓AD病程以及保护神经元作用的具体环节尚不明确，多数研究集中在其对环氧合酶的抑制作用上。研究表明，β淀粉样蛋白（β—amyloid，Aβ）异常代谢、沉积是AD发病的中心环节，Aβ可以刺激脑内主要免疫细胞群小胶质细胞（microglia，MG）释放具有血管活性和免疫特性的重要内源性介质一氧化氮（nitric oxide，NO)及多种炎性细胞因子，从而介导神经元毒性作用。本研究应用BV—2细胞作为MG体外模型，研究吲哚美辛对Aβ1—42刺激BV—2细胞释放炎性介质的调节作用，探讨其神经元保护作用机制，为AD的抗炎治疗提供依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器
Aβ1—42、吲哚美辛购自Sigma公司。RT—PCR试剂盒购自Invitrogen公司。NO试剂盒（硝酸还原酶法）购自南京建成生物工程研究所。
白细胞介素—1β(interleukin—1β, IL—1β)放免试剂盒购自北方生物技术研究所。引物由上海生工公司合成。
1.2 细胞培养和传代
BV—2细胞株购自中国医学科学院协和医科大学基础医学细胞中心。含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基加青霉素100kU/L、链霉素100 kU/L，置37℃、5%CO2培养箱内培养，隔天换液1次，3—4d传代1次。每次实验前细胞在含有1%牛血清白蛋白的DMEM培养基中培养48h后使细胞处于同步化状态。
1.3 药物处理
Aβ1—42溶于去离子水中，浓度为2.5mmol/L，－20℃保存备用；吲哚美辛溶于无菌PBS中，浓度为0.1mol/L，4℃保存备用。以上药物临用前按要求稀释。
1.4 细胞处理
取对数生长期BV—2细胞，以2×105/孔密度接种于6孔培养板中，每组设3个平行孔。本研究应用不同浓度吲哚美辛（10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/L）与20μmol/L Aβ1—42单独或同时加入后培养12h。
1.5 细胞上清NO的测定
取上述各组细胞，分别吸取上清液，应用硝酸还原酶法测定各管吸光度值, 按照试剂盒说明计算各组NO含量（μmol/L）。每组实验均重复3次。
1.6 细胞上清IL—1β的测定 取上述各组细胞的上清液，由专业技师严格按照放免试剂盒要求操作，细胞上清IL—1β浓度按程序自动计算获得,每次实验均重复3次。
1.7 RT—PCR法半定量测定iNOS基因表达 按常规提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。逆转录过程按RT—PCR试剂盒说明书操作，PCR扩增循环参数iNOS为94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 2min,共28个循环，72℃ 终延伸5min；IL—1β为94℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 1min,共30个循环，72℃ 终延伸5min；β—actin为94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 1min，共30个循环，72℃ 终延伸5min。引物序列分别为：iNOS（754bp）正义链5′—CATGGCTTGCCCCTGGAAGTTTCTCTTCAAAG—3′，反义链5′—GCTACCGTGGTAGTCTCCCCTACGACG—3′；IL—1β（382bp）正义链5′—GCAACTGTTCCTGAACTCA—3′，反义链 5′—CTCGGAGCCTGTAGTGCAG—3′；β—actin（175bp）正义链5′—CAGTAACAGTCCGCCTAGAA—3′，反义链5′—GATTACTGCTCTGGCCTCCTA—3′。将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，Tanon GIS凝胶成像分析系统成像，分别计算iNOS基因与β—actin及IL—1β基因与β—actin光密度比值，比较各组间比值大小。每组实验均重复3次。
1.8 统计学处理 数据结果以x－±s表示，多组间均数比较采用SPSS 11.0软件进行方差分析。
2 结 果
2.1 吲哚美辛对Aβ刺激BV—2细胞释放NO的调节作用 20μmol/L Aβ1—42作用6h后细胞上清液可以检测到NO，至12h达高峰（8μmol/L;P<0.01），此后逐渐下降。吲哚美辛单独作用于静止的BV—2细胞对其产生NO无影响，而对Aβ1—42刺激12h后的BV—2细胞产生NO的作用具有部分抑制作用，这种抑制作用在吲哚美辛浓度为10-7—10-5mol/L时较为明显（P<0.05，表1）。
2.2 吲哚美辛对Aβ刺激BV—2细胞释放IL—1β的调节作用 20μmol/L Aβ1—42作用6h后IL—1β升高，至12h达到高峰，约为对照组的3倍，此后逐渐下降。吲哚美辛单独作用于静止的BV—2细胞对其产生IL—1β无明显影响；在与Aβ共同作用于BV—2细胞后，细胞分泌IL—1β的作用被抑制，这种作用在吲哚美辛浓度为10-9—10-5mol/L时较为明显，差异具有显著性（P<0.05，表1）。
2.3 吲哚美辛对Aβ作用后BV—2细胞iNOS mRNA表达的调节作用 20μmol/L Aβ1—42作用6h即出现iNOS mRNA的表达，在12h达高峰，此后逐渐下降。吲哚美辛单独作用于静止的BV—2细胞对其iNOS mRNA表达无影响，而对20μmol/L Aβ1—42刺激12h后BV—2细胞iNOS mRNA表达的增加具有抑制作用，在10-7—10-5mol/L浓度时较为明显，iNOS/β—actin mRNA比值由0.8降至0.6（P<0.05，图1）。
2.4 吲哚美辛对Aβ作用后BV—2细胞IL—1β mRNA表达的调节作用 在20μmol/L Aβ1—42作用4h后IL—1βm RNA出现表达增加，至6h达到高峰，为对照组的3倍，此后逐渐下降。吲哚美辛单独作用时对IL—1β mRNA表达无 明显影响，但与Aβ1—42共同作用12h后，IL—1β/β—actin mRNA比值表达较前降低，在吲哚美辛浓度为10-7—10-5mol/L时该比值降低较为明显，由0.3降至0.22（P<0.05，图2）。
3 讨 论
目前认为炎症是AD发病机制的必要因素之一。AD患者脑组织中大量沉积的Aβ具有很强的神经毒性，不仅可引起神经细胞的退行性改变，还可能是炎症反应的激发因子。Aβ沉积激活MG引起的炎症反应被认为是AD脑结构改变的特征之一，是AD的核心病理机制［2］。AD患者脑中反应性MG为AD炎性以及神经退行性变过程的始动细胞，除作为具有清除斑块作用的清道夫细胞外，也是一系列生物活性物质的来源［3］。研究证实Aβ不仅具有强的直接神经元毒性作用，而且可以激活MG使其释放自由基NO及炎性细胞因子。
在中枢神经系统，NO具有双重活性［4］：一方面作为特殊神经递质参与突触可塑、神经元发育、学习记忆和行为等众多生理机制；另一方面，过量的NO可通过氧化应激，破坏能量代谢过程中的多种酶类使ATP生成减少，损伤膜性结构、蛋白质及DNA，导致神经元坏死或凋亡，从而损伤神经系统。iNOS是一种诱导酶，表达后其活性可持续相当长时间，从而大量、持续产生NO，是介导包括神经变性疾病在内的许多病理过程的重要因素。本实验探讨了Aβ1—42对BV—2细胞产生NO及iNOS表达的影响，结果提示NOS/NO在AD发病机制中可能具有重要作用。
IL—1是一个具有多种功能的、可以诱发炎性反应及机体防御反应的炎性细胞因子,它可以活化T细胞（间接活化B细胞）、提高黏附分子表达、诱导一系列其它前炎性细胞因子以及炎性相关蛋白表达，形成炎性反应的放大级联反应，是中枢神经系统内最重要的炎性细胞因子。IL—1与AD患者脑中淀粉样斑块、神经原纤维缠结的形成、发展关系密切 ［5］ ，其在AD脑内过度表达与神经元退行性变及AD炎性级联反应密切相关。AD的病理生理过程中多种细胞因子如IL—1、IL—6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF—α）等都发生了上调，过多的细胞因子的产生可以导致组织的损伤。在生理条件下，这些前炎性因子的分泌由一些抑制性细胞因子如IL—1Ra、IL—10、β型转化生长因子（transforming growth factor β, TGF—β）等来进行调节，在AD中前炎性细胞因子及其抑制剂之间的失衡可能与其发病机制有关。本实验结果显示，Aβ1—42可刺激BV—2释放IL—1β，并在mRNA水平进行调控。
Aβ诱导MG产生炎性介质的机制目前尚无定论。新近发现小胶质细胞表面的晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end product，RAGE）、A级清道夫受体（class A scavenger receptor，SR）、丝氨酸蛋白酶抑制剂酶复合物受体（secrin proteinase inhibitor—enzyme complex receptor，SECR）可促进Aβ与MG黏附。Aβ通过RAGE、SR和Mac—l与MG结合，激活核因子(nuclear factor κB,NF—κB)及IRF—l途径，诱导炎性细胞因子的表达并产生大量NO［6,7］；MG产生的细胞因子又与Aβ协同诱导星形胶质细胞释放NO；受累的神经元和内皮细胞也因Ca2+稳态失衡而出现NOS表达及活性上调。过量的NO及炎性细胞因子介导并放大氧化应激、炎性级联等反应，通过多种途径损伤蛋白质、脂质和DNA等，导致神经元坏死或凋亡，并形成AD的病理标志神经原纤维缠结及老年斑。与学习记忆有关的神经元(如胆碱能和含nNOS神经元)选择性受损导致了AD的临床表现，通过Aβ—NO—Aβ级联回路和IL—1引发的“细胞因子循环”，使AD的病变程度和范围逐渐扩大，从而表现出进行性的临床特征。
吲哚美辛是环氧合酶（cyclooxygenase，COX）的非选择性抑制剂。COX亦称为前列腺素G／H合酶，是催化花生四烯酸转变为前列腺素（PGs）的关键酶，可分为COX—l和COX—2两型，其中COX—2为可诱导型酶，在脑和脊髓的神经元有生理性表达，其表达水平与炎症的严重程度呈正相关。细胞培养以及转基因动物研究均证实COX—2参与神经元的死亡机制［8］。在AD中由于大量神经元丧失，COX—2的表达和前列腺素E2的含量均减少，但在一些活性星形胶质细胞聚集的脑区COX—2表达增加，它与活化的AC一起参与AD的早期病理损伤［9］。目前认为吲哚美辛至少可通过两种途径抑制胶质细胞和神经元产生PGs：一是作为COX的强烈抑制剂减少PGs合成；二是通过竞争性地与过氧化物酶体增殖剂激活受体—γ（peroxisome proliferators—activated receptor—gamma）结合而调节基因表达［10—12］。
本研究显示，在体外吲哚美辛可降低Aβ介导的BV—2细胞iNOS mRNA及IL—1β mRNA表达，从而减少NO和IL—1β的产生，阻断炎性级联反应，进而阻止炎性介质发挥神经元毒性作用，抑制AD病变程度和范围的逐渐扩大。因此，吲哚美辛对NO和IL—1β合成以及分泌的早期干预可能为其神经元保护作用的重要机制。
此外，吲哚美辛其他可能的作用环节还包括减少RAGEs生成，进而抑制过度的蛋白交连和氧化应激；抑制胶质细胞产生明胶酶（特异性基质金属蛋白酶）等。因此除对COX—1、COX—2具有抑制作用外，吲哚美辛可能还有多种神经元保护作用机制，而我们的研究工作也为进一步探讨NSAIDs的神经元保护作用机制提供了一定的实验依据。
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