摘要：在利用豆粕为氮源生产脂肪酶的过程中，假丝酵母同化豆粕会产生蛋白酶，而蛋白酶在水解豆粕的同时，亦会水解诸如脂肪酶等其他蛋白类物质。发酵第4d时，蛋白酶活力达到最高值6.5U/ml，同时脂肪酶活力增长缓慢。在5U/ml的纯蛋白酶粉体系中，分别加入5000U/ml、10000U/ml的脂肪酶粉，反应4h后脂肪酶活力分别为2500U/ml、3900U/ml；在2个含有较高活力的蛋白酶的已除菌的发酵液体系中，40℃下自水解4h，脂肪酶活力损失分别为20.7%和21.2%。发酵前添加外源蛋白酶水解豆粕，可抑制假丝酵母产生蛋白酶，解除其对脂肪酶的影响，发酵周期可缩短4d。
关键词：脂肪酶发酵；蛋白酶；假丝酵母；酶活损失
中图分类号：S-3文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-03-0076-1
0 前言
脂肪酶(Lipase.EC 3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，是酶制剂中的一员，它是一种重要的工业酶类，应用于油脂水解，食品风味和香味改进，生物能源等方面。脂肪酶是一种酯键水解酶， 将甘油三酯水解为甘油二酯、单甘酯、脂肪酸[1]。常见的包括假丝酵母( Candida sp.) [1-2]、根霉（Rhizopus）、青霉（Penicillium）和假单胞菌（Pseudomonadaceae）等产生的脂肪酶，其中假丝酵母是国内外研究较多的产脂肪酶菌种[3]。
在假丝酵母Candida sp.99-125以往的相关研究中，何耀强等讨论了诸如温度、pH、培养基原料、金属离子等因素对脂肪酶生物合成的影响；朱耀光等为提高菌体对豆粕的利用率，以豆粕水解液为氮源进行脂肪酶发酵；张亮等研究了脂肪酶生物合成过程中脂肪酸、甘油及脂类的变化规律，并发现油酸的消耗致使脂肪酶合成速率加大。而在已有的报道中，只是研究了一些小分子有机物对脂肪酶的影响[9]，而微生物发酵是一个复杂的过程，在假丝酵母合成脂肪酶的过程中，细胞自身会生成众多的酶及酶系，这些生成的酶及酶系必定对目的产物有着或多或少的影响，本文讨论了一种对脂肪酶生成影响最大的酶系——蛋白酶，在发酵过程中活力的变化，并对其降解脂肪酶做了相关的研究与分析，为脂肪酶发酵提供了一种新的改进方法及手段。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、菌种及培养基
1.1.1 试剂 假丝酵母脂肪酶，本实验室制备，酶活为10000U/g；中性蛋白酶，sigma公司，酶活为50000U/g；福林酚试剂，普博欣公司。
1.1.2 菌种 假丝酵母(Candida sp.99-125)，实验室保存。
1.1.3 培养基 初级种子液培养基（g/l）：豆油40，豆粕40，K2HPO4 2，KH2PO4 1；二级种子液培养基（g/l）：豆油40，豆粕40，K2HPO4 2，KH2PO4 1，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4 0.5；发酵培养基（g/L）：豆油40，豆粕40，K2HPO4 2，KH2 PO4 1，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4 0.5，加入适量消泡剂；豆粕水解发酵培养基（g/L）：豆油40，K2HPO4 2，KH2 PO4 1，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4 0.5，加入适量消泡剂；加豆粕40，按蛋白酶：豆粕：水=1:100:500（质量比）加入蛋白酶水解，40℃水浴搅拌水解3h。于121℃，20min灭菌灭酶后使用。
1.2 发酵过程条件
1.2.1一级种子培养 在250ml的锥形瓶中装入50ml一级种子液培养基，121℃下灭菌20min，冷却至26℃后在超净台从试管斜面上接种后放置于转速220r/min的旋转式摇床中，26℃下培养48h。
1.2.2 二级种子培养 在250ml的锥形瓶中装入50ml二级种子液培养基，121℃下灭菌20min，冷却至26℃后在超净台将一级种子液接种到二级种子液培养基中，置于转速为220r/min的旋转式摇床中，26℃下培养60h。
1.2.3 30L发酵罐培养 将发酵培养基（按15L装液量）配好并装入发酵罐内，121℃下灭菌30min，冷却至26℃后接种，搅拌转速300r/min，通气量1L/（L•min）。
1.3 蛋白酶水解脂肪酶过程及条件
1.3.1 纯蛋白酶粉对假丝酵母脂肪酶的水解作用 将蛋白酶配制成5U/ml（0.1g酶粉/L）的溶液，加入脂肪酶，40℃下恒温水浴，于一定时间内测定其脂肪酶活力。
1.3.2 发酵液自身对假丝酵母脂肪酶的影响 取一定时期内的发酵液，8000r/min离心5min取上清液，重复两次，尽可能地除去菌体。40℃下恒温水浴，于一定时间内测定其脂肪酶活力。
空白样品：取上清发酵液100℃沸水浴10min，灭除酶活力后加入相等酶活的假丝酵母脂肪酶粉，40℃下水浴。
1.4 测定方法
1.4.1 脂肪酶酶活力的测定 采用橄榄油乳化液测定法。配制2%(W/V)的聚乙烯醇(PVA 1750)溶液，与橄榄油按体积比3：1混合后高速搅拌10min制得橄榄油乳化液，取5ml乳化液与4ml磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH 8.0)混合，在40℃水浴中预热3min，在空白组中加入20ml95%的乙醇，5min时在空白组和实验组中各加入样液1ml，反应10 min后在实验组中加入20ml95%的乙醇终止反应，以酚酞作指示剂，用0.05mol/L的NaOH溶液滴至液体呈粉红色。与空白样对比计算其酶活。在测定条件下，每分钟释放出1μmol脂肪酸的酶量定义为1个酶活单位(U)。
1.4.2 蛋白酶酶活力的测定 将酪蛋白溶液在40℃恒温水浴中预热5min。取三只试管，一只作为对照组，两只作为试样组。在两只试管中各加入1ml酶液，40℃恒温水浴2min，在对照组中加入2ml三氯乙酸，在试样组中加入1ml酪蛋白，40℃恒温水浴10min，在对照组中加入1ml酪蛋白，在试样组中加入2ml三氯乙酸，静置10min，过滤，在对照组和试样组中各加入5ml碳酸钠溶液和1ml福林酚溶液，40℃恒温水浴20min，显色。将对照组和试样组稀释一定倍数，在680nm下测定其吸光度[4]。将吸光度带入下式计算蛋白酶活力：
蛋白酶活力（U/ml）=A×K×4/10×N
A-样品平行试样的平均吸光度；K-吸光常数；4-反应液总体积；
10-反应时间（以1min计）；N-稀释倍数；（结果取整数）。
1.4.3 α-氨基氮测定 将发酵液试样稀释10倍，取2ml稀释液，加4ml水，再加5滴酚酞。用0.01mol/L的NaOH溶液滴定至微红色；加2ml甲醛，再用0.01mol/L的NaOH溶液滴定至红色，所用NaOH体积记作VNaOH，带入下式计算α-氨基氮的含量[8]：
α-氨基氮的含量（g/ml）=（VNaOH－0.9）×n×0.01×0.014；
0.9-加入甲醛后滴定消耗的NaOH的体积；n-稀释倍数；
0.01-NaOH的浓度；0.014-换算常数。
每次测定四组平行样，取四组平行样的平均值作为最终的测定值。
2 结果与讨论
2.1 脂肪酶发酵过程产生的蛋白酶与α-氨基氮的变化
图1 脂肪酶发酵过程中蛋白酶与α-氨基氮的变化曲线
我们对脂肪酶发酵过程中不同时间蛋白酶和α-氨基氮的含量进行了测定。从图1可以看出，在发酵0-2.5d过程中，蛋白酶活力不高，α-氨基氮含量也很低。脂肪酶酶活在发酵前4d增长迅速且处于稳定增长的趋势。蛋白酶活性在发酵的第4d与第5d迅速增长，并出现了两个酶活最高值，此时脂肪酶的酶活力有下降的趋势。在第5.5d蛋白酶活力开始下降，而脂肪酶活力又开始逐渐增长，直到发酵结束，蛋白酶活力降至较低水平，α-氨基氮含量出现波动。脂肪酶活力达到8000U/ml。通过对发酵过程中蛋白酶和α-氨基氮的含量变化进行分析，我们可以明显认识到，在高蛋白酶含量下，脂肪酶活力增长速率明显减缓，而且脂肪酶酶活出现了下降的趋势，当蛋白酶酶活降低时脂肪酶酶活增长速率增加。这是因为，由于脂肪酶的本质是一种蛋白质，所以在发酵过程中，蛋白酶会降解脂肪酶，从而会影响脂肪酶发酵的最终酶活。因此，我们可以认为，α-氨基氮对脂肪酶的发酵影响不大，而蛋白酶对脂肪酶的发酵具有一定的阻碍作用。
2.2 蛋白酶对假丝酵母脂肪酶的影响
图2 5U/ml蛋白酶对假丝酵母脂肪酶的影响
从图2中可以看出，用5U/ml蛋白酶处理不同酶活力的脂肪酶溶液，在4h后，酶活为10000U/ml的脂肪酶活力仅为3900U/ml；而酶活为5000U/ml的脂肪酶活力仅为2500U/ml，活力只为其初始时的50%左右。也就是说，在脂肪酶中加入蛋白酶，在纯酶粉条件下，蛋白酶会降解脂肪酶，严重影响其活力。而且酶活为10000U/ml的脂肪酶其失活曲线的斜率要大于酶活为5000U/ml的脂肪酶的失活曲线斜率。因此，我们可以得出这样的结论，具有高浓度的脂肪酶酶活溶液降解速率要高于低浓度脂肪酶酶活溶液，也就是说，如果在发酵过程中脂肪酶活力越高，那么在蛋白酶作用下，其降解速率也越快，最终脂肪酶酶活力就会降低。
2.3 含有蛋白酶的发酵液对脂肪酶的影响
图3 蛋白酶对发酵液中脂肪酶的影响
为了检测蛋白酶对发酵液中脂肪酶的影响，我们将发酵液进行离心，然后将离心后的上清液在40℃水浴中处理4h，然后加入蛋白酶。从图3中我们可以看出，将蛋白酶添加到含有脂肪酶的发酵液上清液中，上清液中脂肪酶的活性会降低。而且发酵液的上清液中的脂肪酶活性损失约为20%，相对于纯酶粉的水解（脂肪酶损失50%），其脂肪酶酶活损失减小了30%。这是因为，由于在发酵液中含有其他蛋白类物质，在蛋白质水解过程中，这些蛋白类物质与脂肪酶形成针对于蛋白酶的竞争性抑制[10]，导致只有部分脂肪酶被蛋白酶水解[5]，所以脂肪酶活性损失有所减小。但是，在发酵液中蛋白酶仍然制约着脂肪酶酶活的增长。
2.4 豆粕水解液为氮源发酵脂肪酶
2.4.1 豆粕水解液与豆粕培养基成分对比
表1 豆粕培养基与豆粕水解液培养基中物质对比
2.4.2 豆粕水解液发酵工艺中的蛋白酶变化规律
图4 不同发酵培养基发酵过程中脂肪酶与蛋白酶活力对比
由于豆粕水解液中不溶物质相对较少，且含氮量较高，因此，本次实验我们采用豆粕水解液作为氮源进行发酵。从图4中可以看出，如果在发酵前将发酵液进行水解，由于发酵液中的蛋白类物质被水解[7]，蛋白酶活力变得很低，脂肪酶酶活却增长平稳而且在中后期没有降低，同时达到最高酶活的发酵时间变短。而自然发酵时，发酵培养基没有被水解，蛋白酶具有较高活力，那么在发酵中后期脂肪酶酶活就会出现明显的下降。这是因为蛋白酶为诱导酶，当采用豆粕水解液发酵时，由于豆粕被水解，发酵液中蛋白类物质含量极少，蛋白酶失去诱导物，从而不能大量产生[6]。因此，采用豆粕水解液发酵时，蛋白酶活性会明显降低，脂肪酶没有被蛋白酶所抑制，于是发酵周期缩短4d，发酵结束时最终酶活保持在8300U/ml。
3 结论
（1）在脂肪酶发酵过程中产生的蛋白酶会水解脂肪酶，致使脂肪酶活力下降。
（2）在蛋白酶粉溶液中，脂肪酶活力的损失高于在发酵液中的损失。
（3）在以豆粕水解液为氮源的发酵工艺中，会使产生的蛋白酶活力降低，使得脂肪酶活力损失减小，同时可以缩短发酵周期。
参考文献
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[3] 朱耀光,谭天伟.豆粕水解液为氮源发酵产脂肪酶的研究[J].生物加工过程,2008,6(5):36-39.
[4] 陈安和.几种蛋白酶活力测定新方法[J].生命的化学,
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[5] 廉立慧,吴从平,张显忠,刘锦华,张克勤.产胞外蛋白酶细菌的快速筛选及其发酵产酶条件的初步研究[J].泰山医学院学报,2009,30(5):321-323.
[6] 唐兵,周林峰,陈向东,等.嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质[J].微生物学报,2000,40(2):76-80.
[7].李贵杰,高淑云.大豆浸出制油工艺过程中脲酶活性的研究[J].粮食科技与经济,1997,2:32-33.
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[9] 彭立凤.微生物脂肪酶的研究进展[J].生物技术通报,
1999,2:17-22.
[10] 谢承佳,王雪.微生物碱性蛋白酶的研究进展[J].黑龙江科技信息,2009(34).
作者简介：田野（1983-），男，内蒙古呼和浩特人，内蒙古农业大学生命科学学院发酵工程专业08级硕士研究生，研究方向：发酵工程技术应用。
通讯作者：段开红，内蒙古农业大学教授，硕士生导师。
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