摘要： 为了提高厌氧水解效率，采用双层平板法筛选出一株耐低温兼性厌氧蛋白酶产生菌192。经形态、生理生化和16S rDNA序列分析鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），对其产酶条件进行了初步研究。结果表明，该菌的最适生长温度为30 ℃，生长8～12 h达对数期，初始pH 7.5时酶活力最高。蛋白酶最适反应温度为45 ℃、pH 7.0，酶活力最高达39.3 U/mL。该酶在50 ℃以下，pH 6.0～9.0性能稳定。在60 ℃以上热稳定性很差，70 ℃保存1 h酶活力全部丧失。
关键词：兼性厌氧；耐低温蛋白酶；蜡状芽孢杆菌；酶学性质
中图分类号：Q93-331；Q556 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）04-0807-04
Screening and Identification of Psychrotolerant and Anaerobic Protease-Producing Strain and Characterization of Protease
CUI Guan-hui1，2，XI Yan-hua1，2，CHENG Hui-cai1，2，ZHANG Li-ping1，2，HUANG Ya-li1，2，MA Jin-liang1，3
（1. Institute of Biology， Hebei Academy of Sciences， Shijiazhuang 050081， China；
2. Main Crops Disease of Microbial Control Engineering Technology Reseach Center in Hebei Province， Shijiazhuang 050081， China；
3. College of Life Sciences， Hebei University， Baoding 071002， Hebei， China）
Abstract： In order to improve the efficiency of the anaerobic hydrolysis， the psychrotolerant and anaerobic protease-producing strain 192， was screened using double-plate method. The strain was identified as Bacillus cereus based on the results of morphological， physiological， biochemical and 16S rDNA analysis. Then its optimal protease-producing conditions were studied. The results showed that the optimum growth temperature of this strain was 30 ℃ and its enzyme activity was highest when the initial pH 7.5， after 8～12 h of growth. The optimal reaction condition of this protease was 45 ℃ and pH 7.0， its enzyme activity could be up to 39.3 U/mL. At the conditions of pH 6.0～9.0 and lower than 50 ℃， the protease was stable. The protease was unstable at the temperature higher than 60 ℃， it would completely lose activiy when storing at 70 ℃ for 1 h.
Key words： facultative anaerobic； psychrotolerant protease； Bacillus cereus； enzymatic properties
蛋白酶是一类重要的水解酶，占酶制剂市场的65%以上，除在食品、饲料、添加剂、洗涤、皮革、环保等领域外，在厌氧消化系统中加入蛋白酶，不仅对有机物的去除有作用，而且对厌氧发酵产甲烷也有促进作用[1-3]。Rademacher等[4]通过添加多种酶来提高厌氧污泥消化速率。Scheidat等[5]在初沉池污泥中加入蛋白酶、糖化酶和脂肪酶，发现均能明显地提高水解作用。Romano等[6]研究表明，添加水解酶后，沼气产率从0.35 L/g增加到0.53 L/g，甲烷产率从0.15 L/g增加到0.29 L/g。低温蛋白酶具有低温高催化效率等特性，有着中温、高温蛋白酶无法取代的优越性。因此，从过冬污泥中分离出一株耐低温的兼性厌氧蛋白酶产生菌，并对其生理生化和酶学性质等进行了初步研究，以期为其应用于污水处理及厌氧发酵、提高水解效率和沼气产气率提供菌种和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源 样品采自不同厌氧环境的沼渣沼液、池塘污泥、生活污水等。
1.1.2 培养基 初筛培养基：琼脂粉1.2%，脱脂奶粉1%，pH自然。复筛培养基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 7.2。水琼脂培养基：琼脂粉1.2%、pH自然。
1.2 方法
1.2.1 富集培养 将所取样品加入富集培养基中，在（15±1） ℃培养箱培养3～5 d。
1.2.2 初筛 称取样品10 g用生理盐水按10倍稀释法稀释至10-8。分别取10-5～10-8稀释液1mL置于平板中，倒入牛奶培养基，摇匀。待培养基凝固后，倒入水琼脂培养基。置于（15±1） ℃培养3～5 d，挑取水解圈直径较大的菌株，穿刺保存。将初步选出的菌株在初筛培养基上再进一步进行培养、比较、筛选出透明圈较大的菌株，进行复筛。
1.2.3 复筛 采用国家轻工行业标准QB1805.3-1993中的Folin-酚法测定蛋白酶活力[7]。酶活力定义为1 mL酶液在pH 7.0、40 ℃下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位，以U/mL表示。
1.2.4 菌株鉴定
1）形态观察。采用光学显微镜和扫描电子显微镜观察菌体的形态特征。
2）生理生化鉴定。生理生化鉴定参考《常见细菌系统鉴定手册》[8]。
3）16S rDNA序列分析。以细菌基因组总DNA为模板， 以细菌通用引物进行PCR扩增16S rDNA序列，提交GenBank数据库，并与GenBank核酸序列数据库中的序列进行比对，采用DNAMAN软件进行同源性分析，并构建系统发育树[9]。
1.2.5 产酶条件及酶学性质分析
1） 生长曲线及最佳产酶时间的测定。在pH 7.5，温度（15±1） ℃情况下培养，接种后每隔2 h取样测定OD660 nm，绘制菌株生长曲线。
2） 初始 pH和不同培养温度对酶活力的影响。将培养基pH设定为4.5～9.5，以0.5为1个梯度，测定各个pH下的酶活力，确定其最适pH。设定培养生长温度分别为4、16、22、30、37、45、55 ℃，测定各个培养温度下的蛋白酶活力，确定最适生长温度。
3） 酶学性质分析。分别对酶的最适反应温度、pH和酶的热稳定性、pH稳定性进行研究，具体方法参见文献[10]。
2 结果与分析
2.1 菌株筛选结果
在（15±1） ℃培养72 h后，初筛培养基上可以观察到一部分菌株周围产生肉眼可见的水解圈，根据菌落大小、形态、颜色和水解圈的大小，共挑取374个菌株穿刺培养保存。通过三点法3次考查，最终得到58株透明圈相对较大的菌株，其中有17株透明圈直径与菌落直径比值≥3（图1），对其进行复筛，结果（表1）表明，菌株192酶活力最高，达到35.5 U/mL，且在重复的试验中，该菌株产生的酶活力稳定。因此，选菌株192作为出发菌株，对其进行菌种鉴定及产酶特性研究。
2.3 菌株192的形态特征观察结果
菌株192菌落呈白色、圆形、光滑、湿润、不透明、菌落边缘整齐；菌株长约 1.9～4.0 μm，宽度约 0.8～1.1 μm，革兰氏阳性、杆状、形成芽孢，芽孢椭圆形或柱形，具体见图2。
2.4 菌株192的生理生化特性分析结果
分别对菌株192进行了V-P测定、接触酶、厌氧生长、淀粉水解、酪氨酸水解、吲哚、发酵产酸等试验，结果见表2。
2.5 16 S rDNA序列分析及系统发育树的构建
以菌株192基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到一个长度约为1.5 kb的特异DNA片段，将该PCR产物送北京天根生物制品有限公司进行测序。经过16 S rDNA序列对比，发现菌株192为芽胞杆菌属（Bacillus sp.），与Bacillus cereus的同源性最高，达到99%（图3）。经过形态、生理生化特性、16 S rDNA序列及系统发育分析等确定菌株192为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。
2.6 产酶条件及酶学性质分析结果
2.6.1 菌株192生长曲线和最佳产酶时间 由图4可知，菌体生长0～6 h为延滞期，在6～12 h为对数生长期，12 h时达到稳定期，22 h后开始衰退。由图5可知，随时间变化蛋白酶活力迅速提高，72 h时产酶活力最高，达37.2 U/mL。蛋白酶活力最高与生长最适时间并不一致，其原因可能为所测蛋白酶在培养过程中有累积作用。
2.6.2 初始pH和培养温度对蛋白酶活力的影响 培养基不同初始pH对菌株所产蛋白酶活力的影响见图6。由图6可知，菌株192产蛋白酶的pH范围较宽，pH 5.5～8.5条件下酶活力均在15 U/mL以上，初始pH为7.5时酶活力最高，达到37.5 U/mL。培养温度对产酶影响较大（图7），在16～37 ℃酶活力均大于20 U/mL，30 ℃时酶活力最高，10 ℃以下和45 ℃以上均没有测到酶活力，说明该菌株适宜在偏低温和中温条件下产酶，在高温或低温时酶活力丧失，产酶温度范围相对狭窄。
2.6.3 反应温度和pH对酶活力的影响 由图8可知，菌株192所产蛋白酶最适反应温度为45 ℃，高于或低于45 ℃酶活力均降低，说明该酶为一种中高温酶，反应温度以37～50 ℃为宜。pH对酶活性的影响见图9，该酶最适反应pH为7.0左右，在pH 5.5～8.0都具有较高的酶活力。由此可知该酶pH适用范围较宽，具有广阔的应用前景。
2.6.4 菌株192所产蛋白酶的pH稳定性和热稳定性 该酶在中性、偏碱性环境中比在酸性环境中稳定性好，pH 4.0时蛋白酶很快失活，pH 6.0～9.0时稳定性相对较好（图10）。由图11可知，30、40 ℃保温30 min对酶活力无任何影响，50 ℃保温后酶活力略有下降，当超过60 ℃时酶活力急剧下降，70 ℃酶活力全部丧失。说明该酶在50 ℃以下相对安全。
3 结论
产低温碱性蛋白酶微生物主要集中在一些极端环境中，如深海、冰川、高山、南极和北极的水或泥中，主要有假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、异单胞菌属（Alteromonas）等[11，12]，主要用于洗涤、制革、饲料等工业生产，将低温蛋白酶产生菌用于沼气厌氧发酵提高水解效率的报道很少。此次筛选到的蜡状芽孢杆菌192为兼性厌氧菌，来源于过冬污泥， 16～37 ℃生长，其蛋白酶活力均大于20 U/mL，30 ℃时酶活力最高，适宜于偏低温和中温条件下产酶。生长6～12 h为对数生长期，12 h时达到稳定期，72 h时产酶活力最高，在最适培养条件及反应条件下测得酶活力达39.3 U/mL。该菌株为耐低温菌，生长速度快，初始培养和酶反应pH范围相对较宽。由于水解酶与厌氧发酵产沼气有密切关系[10]，经过初步应用也证实其效果。因此该菌在提高厌氧水解效率，尤其在偏低温和常温条件下处理含蛋白质类物质较多的污水有广阔的应用前景。
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