异常血流动力对TLR4/NF—κB信号传导通路及其下游炎症因子的影响

材料与方法

1.1 细胞株：人脐静脉内皮细胞株ECV304（上海丰寿生物科技有限公司）。

1.2 试剂及仪器：人脐静脉内皮细胞完全培养基、胎牛血清购自上海素尔生物科技有限公司，PCR引物（上海生物工程技术有限公司），反转录试剂盒、qPCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司），TLR4、NF-κB、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）及血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）因子一抗和羊抗兔抗体（二抗）购自上海碧云天生物技术有限公司。Hema9600基因扩增仪、GSG-2000核酸/蛋白凝胶图像分析系统：珠海黑马医学仪器有限公司。细胞综合应力刺激实验系统（型号BIO-CCS13）：3Think公司。

1.3 HUVECs的培养与分组：将HUVECs株ECV-304于37℃、5%CO2的培养箱中用含10%FBS的改良型1640培养基培养传代至4～5代，将细胞以1×105个/ml接种于细胞综合应力刺激实验系统（型号BIO-CCS13）中，待细胞生长良好时随机将HUVECs按所受的应力和压力不同分成应力组、压力组和正常组，每组12孔。对应力组HUVECs施加20dyne/cm2的切应力和15%应变量的张应力。对压力组HUVECs施加12.0kPa的压应力。对正常组HUVECs施加20dyne/cm2的切应力、15%应变量的张应力和12.0kPa的压应力（接近正常生理时血管内皮细胞所受的力）[4]。应力组、压力组和正常组在各自应力的持续作用下，培养24h后收集细胞，以用于后续实验。

1.4 TLR4、髓样分化因子88（MyD88）、肿瘤坏死因子受体相关因子-6（TRAF-6）、NF-κB、TNF-α、LOX-1、ICAM-1及VCAM-1mRNA的检测：采用qPCR的方法检测其mRNA的表达。收集细胞，用Trizol提取总RNA后检测纯度和完整性，用逆转录试剂盒生成cDNA、PCR仪扩增目的基因观察结果。循环参数：95℃预变性7min，30个循环（95℃、45s，57℃、30s，72℃、40s），72℃延伸3min。PCR引物使用Primer5.0引物设计软件从Gene Bank获得，以GAPDH为内参。由上海生物工程技术有限公司合成。引物序列见表1。电泳结束后由GSG-2000核酸凝胶图像分析系统计算得出Ct值，用2-△△Ct方法计算和统计。△△Ct（实验对照组-空白对照组）=△Ct（实验对照组）-△Ct（空白对照组）。

1.5 TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表达检测：采用Western blot法检测目标蛋白的表达。以1×106个/ml浓度收集细胞，用含PMSF（100mM）的裂解液，于冰上裂解30min，离心取上清分装置-70℃冰箱保存备用。用BCA法测定样品蛋白浓度，以每泳道60μg样品蛋白上样，SDS-PAGE电泳后，将分离胶中样品蛋白于电转移槽中转移至硝酸纤维素膜，加适当浓度一抗，室温孵育1.5h，用TBST在脱色摇床上洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的适当浓度的二抗，置室温1h后用TBST洗涤2次，进行化学发光反应、显影、定影，用凝胶图象处理系统分析目标带的净光密度值。

1.6 统计学处理：全部实验数据采用SPSS19.0版统计软件进行分析，计量资料采用（x -±s）表示，资料服从正态分布，直接采用方差分析，组间两两比较用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR4/NF-κB信号传导通路各因子mRNA表达水平比较：见表2。与正常组比较，应力组和压力组各因子mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 三组中TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表达水平比较：见表3。与正常组比较，压力组和应力组TLR4、NF-κB、LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。

3 讨论

TLRs属于I型跨膜蛋白模式识别受体，可表达于多种人类体细胞表面，HUVECs高度表达TLR4。TLRs通过跨膜信号传递作用介导先天性免疫应答和炎症反应，在细胞跨膜活化信号的转导中起着非常重要作用。TLRs通过调节先天性免疫应答和获得性免疫应答而将二者紧密联系[5，6]，TLRs中，TLR4研究的最多且与AS的发生和发展关系最密切。

进一步研究表明激活EC和平滑肌细胞膜表面的TLR4/NF-κB信号传导通路可以诱导其合成与释放大量的与AS相关的炎症因子，这些炎症因子促进AS的发生，而且在AS斑块中TLR4显著高表达[7]。与此同时，TLR4还可以介导巨噬细胞向血管内膜下迁移，同时强烈增殖平滑肌细胞[8]，进入内膜的巨噬细胞吞噬脂质后就形成了泡沫细胞，平滑肌细胞过度增殖和泡沫细胞大量堆积导致AS的形成。Hayashi等[9]研究发现，TLR4缺乏组小鼠与对照组相比其AS斑块面积明显减小。

关于TLR4的研究表明，TLR4信号传导通路包括MyD88依赖性途径和MyD88非依赖性途径，其中前者可激活NF-κB，活化后的NF-κB能够促进其下游的炎症因子（LOX-1、ICAM-1、VCAM-1及TNF-α）高表达。而这些炎症因子均可促进AS的形成[10～12]。

本实验结果表明，在正常生理条件下（正常组）血管内皮细胞同时受张应力、切应力、压力的平衡作用，TLR4这一模式识别受体在平衡力作用下不被激活，MyD88依赖性信号传导通路处于封闭状态，下游LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1等AS标志性炎症因子低水平表达，AS不发生。当血管内皮细胞单独受应力（为张应力和切应力之和）或压力作用时，血管内皮细胞所受应力和压力不平衡（如应力不变，压力小或应力小，压力不变），TLR4在不平衡力作用下被激活，进而激活下游MyD88依赖性信号传导通路，下游LOX-1、TNF-α、VCAM-1及ICAM-1等炎症因子高表达，促进AS的发生和发展。因此，异常血流动力因素通过激活TLR4/NF-κB信号传导通路和增强下游炎症因子的表达，导致AS，这可能是AS发生的机制之一。

参考文献

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（收稿日期：2016-9-3）