右美托咪定预处理对大鼠缺血再灌注肝脏TNF—α及ICAM—1表达的影响

【摘要】 目的：通过右美托咪定预处理对大鼠缺血再灌注肝脏TNF-α及ICAM-1表达的影响，探讨其对肝脏缺血再灌注的保护作用。方法：SD成年雄性大鼠30只，体重150～220 g。随机平均分为3组，每组10只，分别为假手术组（S组），缺血再灌注组（IR组），右美托咪定组（Dex组）。S组和IR组用1 mL/（kg·h）速度静脉滴注0.9%生理盐水30 min；Dex组用右美托咪定5μg/（kg·h）预处理30 min。间隔2 h后IR组和Dex组建立肝脏缺血再灌注模型，S组开腹后不作缺血再灌注。缺血1 h后行再灌注4 h，然后处死大鼠取材。测定大鼠血清ALT和AST，检测肝组织TNF-α活性和ICAM-1水平，观察大鼠组织学病理改变。结果：与S组比较，IR组和Dex组血清ALT、AST和肝组织TNF-α和ICAM-1表达明显升高。Dex组血清ALT、AST酶升高幅度明显较IR组小，肝组织TNF-α和ICAM-1表达低于IR组，肝细胞损伤程度小于缺血再灌注组。结论：右美托咪定预处理能抑制肝缺血再灌注细胞的TNF-α和ICAM-1表达；TNF-α可能通过调控ICAM-1的表达在缺血再灌注损伤中发挥作用。

【关键词】 右美托咪定； 缺血预处理； 再灌注损伤； 肝

在肝脏切除、肝移植等手术或合并肝硬化、失血性休克患者的手术中，肝缺血再灌注损伤是常见并发症，引起临床上广泛关注[1]。肝脏缺血再灌注不但不能使肝组织细胞功能恢复，反而加重了肝脏功能障碍和结构损伤，影响手术的预后。而药物预处理（pharmacological preconditioning， PPC）操作简单，只需要使用药物无需其他特殊仪器设备，安全阈大，近年临床上常用于肝脏缺血再灌注的研究[2]。Teoh等[3]研究表明，小剂量TNF-α预处理可明显改善小鼠肝脏缺血再灌注损伤。右美托咪定作为一种新型的高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，因其具有镇静、催眠、抗焦虑、镇痛及交感神经抑制等作用，近年常用于神经、心脏、肾脏及肺的保护研究。但其对肝脏缺血再灌注的保护作用，目前仍未见有报道。本研究拟通过观察右美托咪定对大鼠肝脏缺血再灌注后TNF-α和ICAM-1表达水平的影响，了解其减轻肝脏缺血再灌注损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠30只，体重150～220 g，年龄8～10周，由中山大学实验动物中心提供。空调室内饲养，室温（20±2）℃，相对湿度保持在（55±10）%，自由进食水，术前12 h禁食，但不禁水。随机分为3组：S组，IR组和Dex组，每组10只。

1.2 实验处理 假手术组（S组）给予生理盐水静滴1 mL/（kg·h）30 min，间隔2 h后仅开腹；肝脏缺血再灌注组（IR组）给予生理盐水静滴1 mL/（kg·h）30 min，间隔2 h后行肝脏缺血1 h，再灌注4 h；右美托咪定预处理组（Dex组）给予Dex 5 μg/（kg·h） 30 min，间隔2 h后行肝脏缺血1 h，再灌注4 h。

1.3 肝缺血再灌注模型的建立 腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后，将大鼠仰卧位固定，腹部脱毛，腹正中线开腹，游离肝脏周围韧带，显露第一肝门，分离肝左叶及中叶的肝动脉、门静脉、胆管分支，并使用无创血管钳夹闭行肝脏部分缺血，以防止发生严重肠系膜淤血。缺血60 min后恢复再灌注，然后用丝线逐层关腹后置鼠笼中恢复，单笼饲养，禁食但不禁水：维持大鼠肛温36～37 ℃。

1.4 血清ALT和AST测定 再灌注4 h后处死大鼠，留取腹主动脉血5 mL，3000 r/min离心10 min，分离血清，分装不同的Eppendorf管中，-20 ℃冰箱保存。应用7600型全自动生化分析仪测定ALT和AST活性。

1.5 细胞形态结构检测 各组于实验结束后均取下大鼠肝脏，用10%的甲醛溶液固定24 h，75%酒精梯度脱水，然后石蜡包埋，切片做HE染色，用光镜观察细胞形态结构变化。

1.6 免疫组织化学法检测TNF-α、ICAM-1的表达 用免疫组织化学两步法将防脱石蜡切片染色。TNF-α浓度和ICAM-1浓度均为1：50，用PBS代替一抗作为阴性对照。阳性是细胞膜和胞浆出现棕黄色颗粒。应用CIAS-1000型细胞图像分析系统，每组随机选择5张切片，每张切片随机选择5个高倍视野，检测相应测试区域的平均灰度及其相应面积、阳性反应产物的平均灰度及其相应面积，根据申洪免疫组织化学染色定量方法求得阳性单位（Positive Unit， PU）[4]。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清酶学检测结果 IR组与Dex组大鼠血清AST、ALT酶水平与S组比较明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；与IR组相比，Dex组ALT、AST酶水平的升高幅度显著较小，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 肝组织学变化 S组肝组织结构清楚，无明显坏死表现；IR组肝小叶结构严重破坏，网状纤维支架塌陷，大片状肝细胞变性坏死，空泡变性，胞浆疏松化，肝细胞索、肝窦充血肿胀，分界不清，大量炎性细胞浸润；Dex组肝细胞损伤程度较IR组减轻，肝细胞轻微肿胀，肝小叶结构尚清，肝细胞变性呈小灶状坏死，有少量炎性细胞浸润。

2.3 免疫组织化学法检测 IR组与Dex组大鼠肝组织TNF-α及ICAM-1表达的PU值与S组相比明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；而Dex组与IR组相比明显下降，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

有研究表明，肝脏缺血后的再灌注能导致肝组织损伤进一步加重[5]。因此，减轻肝脏缺血再灌注损伤将有助于提高肝移植的成功率。Mustafa等[6]研究表明，右美托咪定能减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤。其可能机制：（1）红细胞变形指数的下降；（2）抑制脂质过氧化物的生成。而TNF-α和ICAM-1在右美托咪定保护大鼠肝脏缺血再灌注损伤机制中的作用，尚未有研究。

过往研究证明，TNF-α是一种重要的促炎细胞因子，对肝脏缺血再灌注损伤的激发起到十分重要的作用[7]。TNF-α水平与肝脏损伤程度高度相关。肝脏缺血可导致TNF-α水平升高，后者通过活化炎症细胞，诱导肝细胞凋亡；其介导血栓素、白三烯和前列腺素等多种脂质介质的产生；诱导氧自由基的产生等多种途径导致肝脏损伤。TNF-α不仅可直接导致肝脏损伤肝窦内皮细胞肿胀，而且能使肝窦内皮细胞表面黏附分子的表达显著增加。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族的主要代表，介导黏附反应的一个重要黏附分子，广泛分布于内皮细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞表面。ICAM-1在正常情况下不表达或仅有微量表达，但在内皮细胞损伤时，大量的炎性介质、细胞因子等诱导ICAM-1表达增加[8]。使中性粒细胞与肝窦内皮细胞相互作用的能力增强，导致肝脏微循环障碍。

本实验通过检测血清ALT和AST的水平来评价缺血再灌注损伤后肝脏损伤程度的指标。本研究结果显示，Dex组和IR组大鼠的血清ALT水平明显高于S组大鼠，而Dex组的升高幅度比IR组小。光学显微镜下，S组肝组织无明显坏死表现，而Dex组肝脏损伤明显比IR组轻。提示大鼠肝脏在右美托咪定预处理后对缺血再灌注损伤耐受性明显增强，缺血再灌注造成的肝脏损伤明显减轻。免疫组织化学结果显示，S组大鼠肝组织内皮细胞仅有少量的TNF-α及ICAM-1表达；而IR组肝组织血窦内皮细胞着色呈现强阳性，肝组织内ICAM-1和TNF-α的表达明显增加；Dex组ICAM-1和TNF-α的表达较IR组明显减少，但与S组比较明显增加，这与张锦英等[9]的研究结果相一致。肝脏缺血再灌注引起TNF-α的升高。TNF-α不但可直接导致肝脏内皮细胞肿胀损伤，而且能导致ICAM-1表达水平升高。ICAM-1促使中性粒细胞活化以及与在内皮细胞内黏附和聚集。活化的中性粒细胞释放蛋白水解酶和氧自由基进一步加重肝细胞损害。李洋等[10]的研究也证实了这个观点。ICAM-l通过与其配体LFA-1结合，启动细胞黏附和活化，使中性粒细胞牢固地黏附于血管壁；ICAM-l还介导中性粒细胞的迁移，使其通过内皮细胞全层至肝实质细胞，释放出致肝细胞损伤的蛋白酶和反应性氧原子等物质[11]。

综上所述，肝脏缺血再灌注损伤是包括炎性因子TNF-α激发，ICAM-1过度表达导致中性粒细胞活化及多种信号传导分子参加的复杂损伤过程。本文中，右美托咪定预处理能减轻肝脏的缺血再灌注损伤，其机制可能与抑制缺血再灌注肝细胞的TNF-α水平，调控ICAM-1表达有关。其具体机制，有待以后进一步研究。

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（收稿日期：2013-08-28） （本文编辑：陈丹云）