摘 要 目的：观察壳聚糖对大鼠消化性溃疡愈合的影响，探讨其抗溃疡的可能机制。方法：采用冰乙酸胃窦部浆膜下注射法制备大鼠消化性溃疡模型。70只实验大鼠被随机分成7组，即假手术对照组、模型对照组、泮托拉唑治疗组、硫糖铝混悬液治疗组及3个不同剂量壳聚糖治疗组（ 0.25 g/kg,0.5 g/kg,1.0 g/kg）。按Guth标准记分判定溃疡指数并计算溃疡抑制率；HE染色观察组织结构。采用羟胺法测定超氧化物岐化酶(SOD)，DTNB法测定谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)，TAB法测定丙二醛(MDA)。结果：壳聚糖治疗组与模型对照组比较，溃疡指数明显降低，溃疡抑制率升高（P < 0.01)；1.0 g/kg壳聚糖治疗组大鼠血清SOD、MDA、GSH-Px值与模型对照组均有显著性差异（P<0.05）； 0.25 g/kg壳聚糖治疗组及0.5 g/kg壳聚糖治疗组大鼠血清MDA值与模型对照组比较均有显著性差异（P< 0.05），但SOD、GSH-Px值与模型对照组比较均无显著性差异。结论：壳聚糖可促进冰乙酸溃疡大鼠的溃疡愈合，并呈一定的量效关系。其促进溃疡愈合作用可能与抗氧化机制有关。
关键词 胃溃疡 壳聚糖 抗氧化作用
中图分类号：R97 文献标识码：B 文章编号：1006-1533(2008)05-0219-04
Effect of chitosan on the serum levels of MDA, SOD, and GSH-Px in rats with gastric ulcer
Qu Chunying, Li Dingguo, Wang Yuqin, Chen Meimei
(Xinhua Hospital of Medical Instite of Shanghai Jiaotong University, Shanghai，200092)
ABSTRACT Aim:
To observe the effect of chitosan on the healing of gastric ulcer and explore the possible mechanisms for its action. Methods: Glacial acetic acid was subserosally injected to the gastric antrum of rats to establish the animal model of gastric ulcer. Seventy rats were randomly divided into 7 groups: sham-operated group, model group, pantoprazole-treated group, sucralfate-treated group, and three chitosan-treated groups at low, moderate and high doses (0.25, 0.5, and 1.0 g/kg). The ulcer index was evaluated by Guth method and the inhibition ratio of ulcer formation was calculated. The morphological changes were observed by HE staining. The levels of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px),and malondialdehyde (MDA) were determined by hydroxylamine method, DTNB method and TAB method respectively. Results: The ulcer index was significantly decreased and the inhibition ratio of ulcer formation was significantly increased in chitosan-treated groups compared with model group (P<0.01). The serum levels of MDA, SOD and GSH-Px in chitosan 1.0 g/kg group had significant difference compared with those of model group (P<0.05). The serum level of MDA in chitosan 0.25 g/kg group and 0.5 g/kg group were significantly different with that of model group (P<0.05), but there was no significant difference in the serum levels of SOD and GSH-Px among chitosan 0.25 g/kg group and 0.5 g/kg groups and model group. Conclusion: Chitosan may improve the healing of gastric ulcer induced by glacial acetic acid in rats. The effect was in a dose-dependent manner. The action mechanism of chitosan may be related with its antioxidant activities.
KEY WORDS Ulcer; Chitosan; Antioxidant activity
消化性溃疡是一类常见病、多发病。随着药物治疗的进展，消化性溃疡的愈合率也日趋提高，但不能避免复发。
壳聚糖由甲壳素加工而成，对人体安全无毒［1～3］，可生物降解，具有良好的生物相容性。壳聚糖的水解产物是表皮细胞或组织生长必需的生物活性物质，有利于溃疡局部肉芽组织和新生血管的形成；壳聚糖分子中含有极性基团并带正电荷，溶解于胃酸，形成黏稠的胶，附着在胃壁上形成一层保护膜，阻止胃酸和胃蛋白酶对溃疡面的腐蚀，促进溃疡修复和愈合。国内外动物实验证实［4～9］，壳聚糖有保护胃黏膜、促进胃溃疡愈合作用。本文对壳聚糖抗溃疡的可能机制作一研究。
1 材料与方法
1.1 材料
动物：雄性Sprague-Dawley系大鼠，体重190～250 g，共70只，购自西普尔-必凯实验动物有限公司。
药物：壳聚糖，脱乙酰度92%，华东理工大学提供；泮托拉唑钠肠溶片，沈阳东宇药业有限公司生产；硫糖铝混悬液，上海旭东海普药业有限公司生产。
试剂：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测试盒、丙二醛(malonaldehyde,MDA) 测试盒及谷肽甘肽-过氧化物酶 (glutathione peroxidase ，GSH-Px) 测试盒，均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与模型制备
70只实验大鼠随机分成7组，每组10只。分别为：假手术对照组；模型对照组；泮托拉唑治疗组；硫糖铝混悬液治疗组；0.25 g/kg壳聚糖治疗组；0.5 g/kg壳聚糖治疗组；1.0 g/kg壳聚糖治疗组。大鼠消化性溃疡模型制备采用冰乙酸胃窦部浆膜下注射法［10］。大鼠造模前24 h禁食不禁水，用氯胺酮2 mg/kg腹腔注射麻醉，自剑突下0.5 cm纵向切开腹壁2cm，使胃暴露，用微量注射器在胃前壁胃窦部浆膜下近肌层处注入15%冰乙酸0.05 mL，后回纳胃并覆盖网膜，间断缝合腹膜、腹壁各层。假手术对照组用微量注射器在胃前壁胃窦部浆膜下近肌层处注入0.9%生理盐水0.05 mL代替冰乙酸。
1.2.2 给药
各组大鼠造模后第2日起自由饮食,第3日起给药,每日上午9时灌胃给药, 每日1 次, 总疗程 10日。1)假手术对照组：以生理盐水灌胃；2)模型对照组：以生理盐水灌胃；3)泮托拉唑治疗组： 以20 mg/(kg·d)泮托拉唑灌胃；4)硫糖铝混悬液治疗组: 以200 mg/(kg·d)硫糖铝混悬液灌胃；5)0.25 g/kg壳聚糖治疗组：以0.25 g/(kg·d)壳聚糖灌胃；6)0.5 g/kg壳聚糖治疗组：以 0.5 g/(kg·d)壳聚糖灌胃；7)1.0 g/kg壳聚糖治疗组：以1.0 g/(kg·d)壳聚糖灌胃。实验过程中, 1.0 g/kg壳聚糖治疗组死亡2 只, 1只因造模手术感染致死, 另1只在药物灌胃时呛死。
1.2.3 取材
末次给药后各组大鼠禁食不禁水24 h，给予1 %戊巴比妥钠 (30 mg/ kg) 腹腔内注射麻醉后，门静脉取血静置2~3 h后分离血清，置EP管于-20 ℃冰箱中保存待测。同时取下胃，沿胃大弯剪开，固定在泡沫平板上，用冰生理盐水冲洗，置于2%甲醛溶液中固定10 min，仔细观察每只大鼠的黏膜损伤情况 ,用游标卡尺测量，按Guth标准记录。留取距溃疡边缘 2～3 mm的胃组织,沿经溃疡中心的最长轴的中点纵切，若无溃疡 ,则在相同部位切取1.0 cm×1.0 cm大小的胃组织置于10%甲醛溶液中固定24 h，按照常规脱水，石蜡包埋。
1.2.4 溃疡程度评定
Guth标准记分——点状出血记1分；线状出血，若宽度<1 mm，糜烂长度<1 mm记2分，1~2 mm记3分，2~4 mm记4分，>4 mm记5分；若宽度>1 mm，以上分值×2。
溃疡抑制率：溃疡抑制率= (模型对照组溃疡指数- 治疗组溃疡指数)/ 模型对照组溃疡指数×100%。
组织学检查：大鼠胃组织以10%甲醛固定24 h，石蜡包埋，连续切片（4 μｍ），HE染色观察组织结构。
血清学检查：SOD测定方法，采用羟胺法；GSH-Px测定方法，采用DTNB法；MDA测定方法，采用TAB法。
1.3 统计分析
应用SPSS12.0统计软件，计数资料以 ±s表示。多组间比较采用方差分析，组间差异采用Newman-Keuls法，P值< 0.05为差异有显著性。偏态分布计量资料结果用四分位数表示，组间变量比较用多个独立样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis法），P值< 0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 溃疡指数
如表1所示，各药物治疗组溃疡指数较模型对照组都明显降低 (P< 0.01) ,其中又以泮托拉唑治疗组及1.0 g/kg壳聚糖治疗组溃疡指数值最低。
2.2 组织学检查
HE染色：可见假手术对照组大鼠胃黏膜形态规则的黏膜上皮层、固有膜和黏膜肌层，在固有膜内分布有整齐的管状胃腺，接近上皮区域形成胃小凹。模型对照组溃疡灶表面无黏膜覆盖，黏膜下层组织消失，代之以坏死组织及大量炎性细胞浸润，肌层肌纤维结构不清，见有富含毛细血管的肉芽组织，内含有成纤维细胞、炎性细胞及巨噬细胞等，底部有瘢痕形成。各药物治疗组被覆黏膜形态呈现较大的差异：泮托拉唑治疗组和1.0 g/kg壳聚糖治疗组大多数溃疡灶表面被覆黏膜已形成了上皮、固有膜和黏膜肌层，其黏膜厚度与皱襞接近正常黏膜，虽无胃腺形成，但这些组织的被覆确是溃疡愈合的象征；硫糖铝混悬液治疗组和0.5 g/kg壳聚糖治疗组溃疡灶被覆黏膜多形成了完整的上皮和固有膜，但其黏膜厚度略薄；0.25 g/kg壳聚糖治疗组溃疡灶被覆黏膜形态最差，其被覆的薄层黏膜仅见上皮和少量固有膜，且皱襞粗大而不规则。
2.3 各组大鼠血清SOD、MDA、GSH-Px含量测定
如表2所示，1.0 g/kg壳聚糖组、硫糖铝混悬液治疗组及泮托拉唑治疗组大鼠血清SOD、MDA、GSH-Px值与模型对照组均有显著性差异（P< 0.05）；0.25 g/kg壳聚糖组及0.5 g/kg壳聚糖组大鼠血清MDA值与模型对照组比较均有显著性差异（P< 0.05），但SOD、GSH-Px值与模型对照组比较均无显著性差异。
3 讨论
氧自由基是具有非偶电子的基团和分子，是正常生化过程中的中间产物。在正常情况下，机体在代谢过程中产生的自由基代谢产物及其清除系统保持着动态平衡；SOD和GSH-Px是清除体内氧自由基的一组重要的酶，其活性下降会导致氧自由基代谢产物在体内的堆积。MDA是氧自由基氧化生物膜多不饱和脂肪酸产生的降解产物。其含量升高，反映了体内氧自由基代谢产物的增多。氧自由基在体内的堆积对细胞有明显的损害作用，可以直接破坏细胞膜和遗传结构，使具有膜结构的内质网、溶酶体及线粒体等结构破坏［12，13］。消化性溃疡的发生也与氧自由基损伤有关，研究证实，在高原缺氧地区，SOD和GSH-Px活性明显降低，而MDA含量显著升高，因此在高原地区消化性溃疡的发病率明显高于平原［14～16］。高静等［17］也发现消化性溃疡患者血中MDA明显升高，而SOD、GSH-PX活性均明显低于正常对照组。
壳聚糖具有抗氧化作用，Tae等［18］研究显示，壳聚糖可通过提高SOD酶的活力减轻四氯化碳介导的肝细胞损害。Anandan等［7］做的实验显示甲壳素及壳聚糖有促进盐酸-乙醇溃疡大鼠的溃疡愈合作用，部分原因在于改善溃疡黏膜的SOD、过氧化氢酶及GSH-Px等的活性。本实验证实1.0 g/kg壳聚糖治疗组可增强大鼠体内SOD及GSH-Px的活性，各剂量组壳聚糖均减少了氧化代谢产物MDA的含量，这意味着壳聚糖可能通过增强抗氧化酶的活性，减轻溃疡局部炎症介导的氧自由基损伤，进而促进溃疡愈合。
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(收稿日期：2008-03-14)
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