材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜的羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉 扬州市邗江区窦庄农贸市场；火
基因组DNA抽提试剂盒 北京天根生化科技有限公司；
2×PCR Mix 南京博尔迪公司；电泳上样缓冲液
宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖 美国Promega公司；荧光染料预混液：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BioPhotometer Plus核酸蛋白检测仪、5331 PCR仪 德国Eppendorf公司；7500实时荧光PCR扩增仪 美国ABI公司；GBox凝胶成像分析系统 基因有限公司。
1.3 方法
1.3.1 DNA提取
将9 种动物肉样分别搅碎至肉糜状，备用。使用Beyotime基因组DNA小量抽提试剂盒提供的蛋白酶K法提取各样本的DNA。经核酸蛋白检测仪测定，9 种动物肉样的DNA模板质量浓度在110～210 ng/μL之间，其中鸡肉为174.57 ng/μL。
1.3.2 引物设计与合成
以Genbank上公布的羊、牛、猪、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭、鹅的线粒体DNA COⅠ基因序列为靶基因，通过Arraydesigner 2.0、Oligo 6.0和Primer Premier 5.0软件进行比对分析，设计合成鸡特异性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司负责合成，引物序列、DNA熔解温度（melting temperature，Tm）、PCR扩增片段大小和产物序列如表1所示。
1.3.3 常规PCR扩增与测序
20 μL反应体系：2×PCR Mix 10 μL、10 μmol/L正向引物和反向引物各0.2 μL、模板1 μL、双蒸灭菌水8.6 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 个循环，最后72 ℃延伸10 min。反应结束后用15 g/L琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，电泳结束后割胶回收、纯化，交由上海华大基因科技有限公司进行双向测序，将测序结果与GenBank上的已知序列进行比对。
1.3.4 荧光定量PCR扩增
15 μL反应体系：Mix 7.5 μL、染料（Dye）0.3 μL、1 μmol/L正向引物和反向引物各0.5 μL、模板1 μL、双蒸灭菌水5.2 μL。反应条件：50 ℃酶激活2 min，95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，40 个循环。反应结束后，观察各动物模板DNA的扩增曲线及循环阈（cycle threshold，Ct）值，判定引物的特异性。若无典型扩增曲线且Ct值大于35，则检测体系无特异性扩增。
1.3.5 灵敏度实验
将DNA模板分别稀释101～108 倍，测定方法的灵敏度，反应条件同1.3.3和1.3.4节。
1.3.6 实际样品检测
随机抽取市售火腿肠和腊鸡腿作为样品，利用本研究建立的方法进行检测。
1.4 数据处理
应用7500实时荧光PCR扩增仪自带软件对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，确定扩增产物的Tm值和熔解曲线。
2 结果与分析
2.1 常规PCR扩增结果
由图1可知，用鸡特异性引物分别与不同动物的DNA模板进行扩增时，仅鸡的DNA模板扩增出195 bp的条带，而其他物种的DNA模板无扩增。由图2可知，将鸡的DNA模板按10倍梯度进行稀释，当稀释倍数达104，即DNA模板质量浓度为17.457 pg/μL时仍有特异性条带出现，表明检测灵敏度达到pg级。
2.2 荧光定量PCR扩增结果
以设计筛选的鸡特异性引物作为引物，以9 种动物的肌肉DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测。由图3及表2可知，只有鸡的肌肉DNA模板出现了典型扩增曲线，且Ct值为21.78，而其他动物的肌肉DNA模板均未出现典型扩增曲线。
2.3 荧光定量PCR的灵敏度检测
将鸡的DNA模板分别稀释101～108 倍，采用2 种體积的引物（上、下游引物浓度均为10 μmol/L）进行方法的灵敏度检测，确定方法的检测下限。由图4～5及表3可知，当引物体积为0.05 μL时，稀释103 倍的鸡DNA模板有典型扩增曲线，且Ct值小于35，此时鸡DNA模板质量浓度为175 pg/μL；当引物体积为0.20 μL时，稀释104 倍的鸡DNA模板有典型扩增曲线，且Ct值小于35，此时鸡DNA模板质量浓度为17.5 pg/μL。表明所建立的荧光定量PCR方法灵敏度较高，达到pg级。
2.4 实际样品测定
对大、中型超市和农贸市场的相关样品进行抽检，火腿肠及腊鸡腿肉样品均通过优化后的十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法[14]进行DNA提取。由表4可知，标识主要原料肉为鸡肉的火腿肠和腊鸡腿中检测出鸡源性成分，而标识主要原料肉为猪肉和牛肉的火腿肠中未检测出鸡源性成分，表明该方法可以用于畜禽肉与肉制品中鸡源性成分的快速、有效检测。
3 讨 论
近年来，肉类掺假等食品安全事件屡屡发生，建立畜禽肉中动物源性成分的快速鉴别技术显得尤为重要[15-17]。目前我国肉类掺假识别方面的技术相对落后，肉类制品掺假的定量检测方法和相关国家标准仍为空白[18]。随着人们对食品安全的日益重视以及分子生物学等技术的飞速发展，动物源性成分的多种检测技术相继涌现[3，19]，其中以核酸检测为基础的食品中肉类成分的鉴别与分析技术已逐渐成熟[20-21]。
荧光定量PCR技术近年来迅速发展，具有简单、快速、灵敏度和准确性高等优点，不仅可以提高肉与肉制品中动物源性成分定性检测的准确性，而且使得定量检测成为可能，应用前景非常广阔[22-24]。齐春萌等[25]根据鸵鸟线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COXⅠ）基因序列设计特异性引物和Taq Man探针，建立了肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR鉴定方法。许如苏等[26]基于马的种属保守序列设计特异性引物和Taq Man-LNA探针，建立了可快速检测肉制品中马源性成分的Taq Man-LNA荧光PCR检测方法。冯震等[27]以线粒体细胞色素b（cytochrome b，Cytb）基因的核苷酸序列为检测靶点，设计并优化引物，建立了基于荧光定量PCR技术的生鲜肉中牛、羊源性成分的检测方法，并对方法的特异性和灵敏度进行了验证。
目前，有关畜禽肉中鸡源性成分检测方法的研究报道相对较少，而且已有报道中涉及到的动物种类较少[28-29]。
本研究根据羊、牛、猪、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭、鹅9 种动物线粒体DNA COⅠ基因序列的位点差异设计鸡特异性引物，进行常规PCR和荧光定量PCR扩增检测。结果表明，所选定的引物对只有在鸡模板DNA存在的情况下才会发生反应，产生特异性扩增条带和扩增曲线，而与羊、牛、猪、兔、鸽、鹌鹑、鸭、鹅8 种动物的DNA模板均无反应，可见所设计筛选的引物特异性较好，可以用于畜禽肉中鸡源性成分的快速、准确检测。该方法的建立不仅可以完善我国肉与肉制品中鸡肉掺假的定量检测方法，也为打击肉类产品的掺杂、掺假等违法违规行为提供了技术保障，对于政府部门的监督管理工作具有极其重要的意义。
4 结 论
本研究以线粒体DNA COⅠ基因为靶基因，设计筛选出了鸡特异性引物，采用常规PCR和实时荧光定量PCR技术建立了畜禽肉中鸡源性成分的快速、准确定量分析方法，方法特异性较好，灵敏度较高，可达pg级。
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