银杏叶提取物对牙龈卟啉菌膜泡抑制,牙周膜成纤维细胞活性的影响

【摘要】 目的 探讨银杏叶提取物(GBE)对牙龈卟啉菌(Pg)膜泡(ECV) 的影响。方法 采用酶动力学方法, 测定银杏叶提取物对膜泡生物活性的阻断作用和膜泡对人牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性的影响。结果 与空白对照组相比, 50μg/ml ECV可明显抑制人牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶(ALP)的活性(P<0.01), 与膜泡组相比差异有统计学意义(P<0.01), 且随着浓度升高而升高。结论 膜泡生物活性可被银杏叶提取物有效阻滞, 从而促使牙周膜成纤维细胞向成骨细胞转化,有利于病变的愈合。

【关键词】 银杏叶提取物；牙周膜成纤维细胞；牙龈卟啉菌膜泡牙周膜成纤维细胞是牙周组织的牙骨质再生、骨组织修复的细胞基础。在牙周组织病变恢复过程中, 牙周组织形成的主要细胞是牙周膜成纤维细胞, 它具有较高的碱性磷酸酶活性和多向分化潜能［1］, 它的活性能够通过碱性磷酸酶活性的高低客观地反映。然而, 在牙周组织病损部位, 牙周组织重建及再生达不到很好的效果, 主要是因为数量和来源极为有限。本次采用体外细胞培养法, 研究人牙周膜成纤维细胞活性受牙龈卟啉菌膜泡影响情况, 及银杏叶提取物如何阻断膜泡的生物活性, 为临床治疗牙周病提供了一种实验基础。

1材料与方法

1. 1ECV提取［2］ 及细胞培养将菌种接种于改良模型(GAM)血液琼脂培养基中进行培养, 对培养72 h的细菌培养物, 用超速离心法进行离心, 取上清液(含ECV)备用；取临床上11~15岁因正畸拔除的上颌或下颌双尖牙, 要求牙周牙体组织健康。拔牙前局部消毒。准备预冷细胞培养基(DMEM)培养液, 拔牙后立即放入同时送往实验室。采用胰蛋白酶消化法(按1:3)传代, 选取第5~7代细胞用于实验观察。

1. 2实验方法利用生长良好第6代细胞, 随机分为空白对照组、膜泡组(50 μg/ml)、银杏叶组(含GBE浓度分别为0.1、0.01、0.001 mg/ml)+膜泡(50 μg/ml), 每组设4个复孔, 并分别加入上述所需药物每孔100 μl, 置培养箱中培养48 h。取出细胞培养板弃去上清液, PBS清洗3次, 每孔加入1 g/LTriton X-100各50 μg, 4℃冷藏过夜, 在显微镜下观察。

2结果

当50 μg/ml ECV加入细胞培养物中, 人牙周膜成纤维细胞ALP的活性明显抑制, 与对照空白组相比差异有统计学意义(P<0.01)。当加入不同浓度银杏叶提取物时, 人牙周膜成纤维细胞ALP的活性明显增高, 与ECV 组相比差异有统计学意义(P<0.01), 且随ALP的活性随银杏叶提取物浓度的升高而增高, 具有一定的浓度依赖性, 见表1。

表1ECV抑制人牙周膜成纤维细胞活性受

银杏叶提取物的影响( x-±s, n=4)

药物分组OD值((n=4,x-±s)

空白对照组0.29±0.01

膜泡组0.07±0.01a

膜泡+0.001 mg/ml GBE0.16±0.02b

膜泡+0.01 mg/ml GBE0.19±0.02b

膜泡+0.1 mg/ml GBE0.24±0.01b

注：与空白对照组比较aP<0.05；bP<0.01

3讨论

牙周炎是常见的慢性感染性口腔疾病, 主要病原菌是Pg。它是游离入周围微环境的一种外膜芽生体［3］, 其胞外膜泡经过细菌外膜向外膨。不仅透过细菌本身不能穿透的解剖屏障, 而且能达到更深的组织导致破坏, 结果使牙齿松动甚至脱落。治疗牙周炎是使病变部位能有一定健康数量的牙周膜细胞(PDLCs)从而建立牙周组织的新附着, 是治疗牙周炎的前提。PDLCs是牙周膜中最主要细胞, 具有大量胶原物质的分泌和合成的功能, 因此有利于病变的牙周组织的再生, 有助于牙周组织的修复, 是牙周炎治疗后形成牙龈与牙根面之间新附着的主要细胞来源。

本次试验研究显示: 50 μg/ml ECV加入人牙周膜成纤维细胞培养物中, 它的活性明显受到抑制, 可能通过抑制牙周膜成纤维细胞的活性, 泡膜导致PDLCs数量减少, 进而在牙周组织病变修复过程中, 能够阻止成纤维细胞向成牙骨质细胞或成骨细胞的分化, 阻碍硬组织与骨性修复的钙化, 从而使病变的牙周组织的转归与修复受到影响。当50 μg/ml ECV和3种银杏提取物不同浓度分别同时加入细胞培养物中后, 细胞的ALP活性, 说明在病变修复过程中, 银杏提取物可能通过阻断ECV及抑制牙周膜成纤维细胞ALP的活性, 促进牙周膜成纤维细胞转化成骨细胞, 有利于愈合病变。这一结果也为牙周病的治疗提供一定的参考意义。

参考文献

［1］ 李德懿. 牙周病微生物学新探.国外医学口腔分册, 1986, 3(15): 147-151.

［2］ 倪龙兴, 史俊南, 陈晓玲. 成人唾液对牙龈卟啉菌及其提取物毒理学作用的影响.中华微生物学和免疫学杂志, 1997, 17(1) : 21.

［3］ 高学敏.中药学.北京: 人民卫生出版社, 1991: 345-239.

［收稿日期：2014-03-27］