β—胡萝卜素发酵及提取工艺的研究

材料与方法

1.1材料

1.1.1原料。β-胡萝卜素发酵液，实验室自制，三孢布拉氏霉菌发酵法制得。

1.1.2主要试剂。β-胡萝卜素（标准品），阿拉丁试剂（上海）有限公司；石油醚（沸程30～60 ℃），天津市富宇精细化工有限公司。

1.1.3主要仪器与设备。全温振荡培养箱（HZQ-F160型），哈尔滨东联电子技术有限公司；电热恒温培养箱（303A-5型），上海阳光实验仪器有限公司；真空冷冻干燥机（MAXI-DRY LYO型），法国Heto-holten；电热恒温鼓风干燥机（DHG-9070型），上海精宏实验设备有限公司；紫外分光光度计（8823B型），北京宾达英创科技有限公司；电子天平（AL204型），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1菌丝体预处理。将三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）“+”、“-”菌株分别接种到PDA培养基上，在28 ℃温度下培养72 h。待菌株长出孢子后将菌落转接三角瓶发酵培养基中，在28 ℃分别摇床培养72 h得到发酵液，其中培养基组分包括：玉米粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁。将所得到的“+”菌发酵液取10%，接入“-”菌发酵液中，在28 ℃摇床培养4～6 d。最终得到的发酵液采用滤网过滤，利用5 L自来水洗涤，得到含β-胡萝卜素的三孢布拉氏霉菌菌丝体。

1.2.2β-胡萝卜素标准曲线的绘制。精确称取β-胡萝卜素标准品50 mg，用分析纯的石油醚稀释定容至50 mL，吸取定容后的溶液1.0 mL 用石油醚继续稀释定容至100 mL，此稀释液含β-胡萝卜素10 μg/mL；分别吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 含β-胡萝卜素10 μg/mL 的稀释液，用石油醚定容至25 mL，此时β-胡萝卜素标准溶液浓度梯度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 μg/mL；然后以石油醚为空白对照，采用分光光度计测定450 nm波长处每个梯度标准溶液的吸光值；以标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线1。

1.2.3β-胡萝卜素含量的测定。收集发酵液中的菌体，经干燥箱或真空冷冻干燥后得到干菌体；用研磨法粉碎细胞，然后过 60～80目筛；准确称取菌体粉末0.02 g，菌体粉末放入烧杯，加入石油醚玻璃棒搅拌，萃取直至菌体粉末无色为止；用滤纸过滤萃取后的上清液，滤液倒入100 mL容量瓶定容；取1 mL溶液，用石油醚定容至25 mL；根据β-胡萝卜素的特征吸收波长在450 nm条件下，用分光光度法测定吸光值，利用回归方程计算出β-胡萝卜素含量。样品β-胡萝卜素含量的计算公式如下：

样品β-胡萝卜素含量（mg/g 干菌体）=（C×D×V）/（1 000×m）

式中，C为由标准曲线查得或由回归方程算出的样品的溶液浓度（μg/mL）；D为色素萃取液的稀释倍数（25倍）；m为萃取所用的干菌体样品质量（0.02 g）；V为萃取所用的石油醚体积（100 mL）；1 000为将 β-胡萝卜素含量单位由 μg/g 换算成 mg/g。

β-胡萝卜素的含量（mg/L 发酵液）=菌体干重（g/L）×样品β-胡萝卜素含量（mg/g 干菌体）

1.3干菌体制备方法

1.3.1烘箱干燥法制备。菌丝体预处理过程，同“1.2.1”。将洗涤好的含β-胡萝卜素的三孢布拉氏霉菌菌丝体放入40 ℃烘箱烘干4 h，直至菌丝体恒重，将干燥好的菌丝体取出，用研钵研磨粉碎细胞，然后过60目筛，得到烘箱干燥法干燥含β-胡萝卜素的三孢布拉氏霉菌粉。

1.3.2真空冷冻干燥机法制备。菌丝体预处理过程，同“1.2.1”。将洗涤好的含β-胡萝卜素的三孢布拉氏霉菌菌丝体预冻，再利用真空冷冻干燥机干燥4 h，直至菌丝体恒重，将干燥好的菌丝体取出，用研钵研磨粉碎细胞，然后过60目筛，得到真空冷冻干燥机法干燥含β-胡萝卜素的三孢布拉氏霉菌粉。

2结果与分析

2.1β-胡萝卜素标准曲线通过检测不同浓度的β-胡萝卜素标准品吸光度，绘制了其标准曲线，如图1。β-胡萝卜素标准曲线回归方程为：y=0.118 7x-0.001 7，R2=0.997 5，线性区间为0～1.6 μg/mL，其中x（μg/ml）为标准品浓度，y为波长450 nm处吸光度。

2.2发酵时间对β-胡萝卜素得率的影响微生物的生长经历调整期、生长期、稳定期和衰亡期，因此发酵时间对菌体生长和代谢产物的产量影响比较大，为了积累更多的β-胡萝卜素，需要确定最佳发酵时间。图2表示菌体干重和菌体中的β-胡萝卜素含量随时间的变化，从图2可以看出，两者均在发酵第5天时最高，其值分别为6.7 g/L和58.127 mg/g（冻干机干燥法检测结果）。这说明发酵第5天时，三孢布拉氏霉菌的生长处于稳定期，菌体数量积累最多；同时，细胞内合成β-胡萝卜素的酶系已完全形成，因此积累了大量的β-胡萝卜素。从图3可以看出，发酵液中β-胡萝卜素含量的最高值也出现在发酵第5天，即0.44 g/L。唐玲在文献中报道，三孢布拉氏霉菌在第5天进入细胞生长稳定期[9]，这与该试验中得到的结论一致。因此选择5 d为最适发酵周期，后续试验均采用发酵5 d的发酵液。

2.3不同干燥法对β-胡萝卜素含量的影响天然β-胡萝卜素在干燥过程中很容易被氧化，降低其生物活性，因此，在β-胡萝卜素干燥过程中找到一种低氧化率的干燥方式非常重要。常用的菌体干燥法有：干燥箱干燥法和真空冷冻干燥机干燥法，前者应用最广泛，操作方便、设备简单；后者因其干燥过程不经过水分的液态转化而直接升华，能保持物料的物理性质和化学组成，但生产成本较高。该试验以三孢布拉氏霉菌菌丝为原料，采用此2种干燥法分别制得干菌体，比较了这2种干燥法对β-胡萝卜素含量的影响，结果见图4。

从图4可以看出，使用真空冷冻干燥机干燥制得的干菌体中的β-胡萝卜素含量明显高于烘箱干燥制得的干菌体中的β-胡萝卜素含量。图5是β-胡萝卜素的分子结构式，可以看出β-胡萝卜素分子具有多双键结构，对光、热、氧等因素都很敏感，很容易氧化分解和异构化[10-11]。因此，β-胡萝卜素在低温真空条件下稳定性更好，在较高温度（40 ℃）和空气接触环境中更容易被氧化。考虑到β-胡萝卜素是一种高附加值的产品，降低β-胡萝卜素的氧化降解率对收益率的提高影响较大，在菌体干燥工艺中应选择真空冷冻干燥法干燥菌体。

2.4保藏方式对β-胡萝卜素降解的影响由于β-胡萝卜素分子中含有很多共轭双键，化学性质不稳定，很容易被氧化降解，保藏方式对β-胡萝卜素的降解有很大的影响。首先，图6中比较了未经保藏的β-胡萝卜素和经过20 h避光10 ℃保藏（分别稀释2 500倍低浓度保藏和稀释100倍高浓度保藏）的β-胡萝卜素干粉中β-胡萝卜素含量。从图6可以看出，菌体中β-胡萝卜素和发酵液中的β-胡萝卜素经过20 h的保藏，其含量均有明显下降。从图6中还可以看出，低浓度（石油醚稀释2 500倍）保藏的β-胡萝卜素溶液中的β-胡萝卜素残留比高浓度（石油醚稀释100倍）保藏的更多。这是因为低浓度时溶液中β-胡萝卜素物质的量少，底物与氧气接触的概率要小很多，导致β-胡萝卜素降解率下降。

因此，β-胡萝卜素发酵液的干燥和干粉的提纯工艺都应在下罐之后较短的时间内完成，这样才能降低β-胡萝卜素的氧化降解。在β-胡萝卜素后处理过程中如需保藏，应在低浓度条件下保藏，从而降低其损失。

安徽农业科学2016年3结论

综上所述，利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素5 d为最适发酵周期；在菌体干燥工艺中选择真空冷冻干燥法干燥菌体；β-胡萝卜素发酵液的干燥和干粉的提纯工艺都应在下罐之后较短的时间内完成为宜；低浓度保藏方式有利于降低β-胡萝卜素的降解率。在此条件下制得的β-胡萝卜素胞内含量为5.80%，发酵液中β-胡萝卜素含量可达到0.44 g/L。

该研究中得出最佳发酵时间、最适干燥法和最适保藏方式，最大限度地降低了制取过程中β-胡萝卜素的氧化降解损失，可为利用三孢布拉氏霉菌发酵法制取β-胡萝卜素工艺提供参考依据。

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