摘要：针对水稻黑条矮缩病毒S6、S10两条RNA双链，参考相关文献，设计了2对引物，通过RT-PCR获得了2条干扰片段，将这些干扰片段分别构建到RNA干扰载体中，进一步将整个RNA干扰片段构建入以玉米泛素Ubi为启动子、以生物安全性的bar基因为选择标记的植物双元表达载体pCA1300-Ubi中，经农杆菌介导对黄淮稻区主栽水稻品种圣稻13进行遗传转化，为下一步对水稻黑条矮缩病的研究及抗性品种的培育提供候选材料。
关键词：水稻黑条矮缩病；RNA干扰（RNAi）；Ubi启动子；bar基因
中图分类号：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0019-06
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，亚洲近3/4的人口以食用稻米为主。目前我国水稻常年种植面积约占全国粮食种植面积的30%，其产量占我国粮食总产量的40%以上。因此，稻米产量的高低及品质的优劣直接关系到人们的生活及健康，已受到人们越来越多的重视。
水稻黑条矮缩病（ rice black-streaked dwarf disease， RBSDD） 是由水稻黑条矮缩病毒引起的、由灰飞虱传播的一种病毒病，主要分布于中国、朝鲜、韩国和日本等东亚国家和地区， 对水稻、大麦、小麦、玉米等禾谷类作物造成危害。在20世纪60年代，该病曾广泛发生在我国华东诸市， 之后有一段沉寂期；20世纪90年代后期， 该病在浙江省再次爆发流行， 且蔓延速度非常快，对包括浙江、上海、江苏、安徽、江西以及福建北部在内的长江流域中东部整个稻作区的水稻生产造成毁灭性危害，发病田块一般减产10%～40%，重病田甚至绝产，造成了巨大的经济损失[1]。目前，对于水稻黑条矮缩病的防治主要是农药防治传毒介体灰飞虱，但由于介体昆虫种群数量大，防治效果不佳且对环境的影响较大。种植抗病品种是减轻农作物病虫害最经济、有效和环保的途径，但目前还未筛选到优良的抗水稻黑条矮缩病的抗性品种，因此筛选和培育抗水稻黑条矮缩病的水稻新品种显的尤为重要。
水稻黑条矮缩病毒（ Rice black-streaked dwarf virus， RBSDV） 属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus），全基因组测序工作已经完成，总长29 141 bp，至少含有13个开放阅读框[2， 3]，由10条dsRNA组成，按分子量大小分别命名为S1～S10，这10条基因组片段均具有保守的末端寡核苷酸片段 （5′GUUUUU-and-GUC 3′），该末端序列的保守性被确定为植物呼肠孤病毒科分类的一个重要标准，是病毒RNA而非寄主RNA包装的信号[4， 5]。其中病毒RNA 依赖的RNA 聚合酶、外壳蛋白、沉默抑制子等重要基因的功能已经基本明确，本研究选取的RBSDV基因组中S6、S10基因编码的蛋白分别为RNA沉默抑制子[6]和病毒外层衣壳。这为进一步利用基因工程手段培育转基因水稻抗病新品种奠定了基础。
RNA干扰是指设计合成与病毒同源的dsRNA，导入植物体并形成发夹结构，在植物体内对病毒基因组进行特异性酶切降解，抑制病毒扩张，从而使植物具有抗病毒能力。由于该方法可有效抑制目的基因的表达，对目的基因的表达具有可控性，近年来被广泛应用于新品种的培育。本实验参照水稻黑条矮缩病毒基因组中S6、S10的部分片段构建了RNA干扰载体，进一步通过农杆菌介导对水稻愈伤组织进行遗传转化，获得了部分转基因阳性植株，为下一步抗水稻黑条矮缩病水稻材料的筛选及培育提供了候选材料。
1材料与方法
11植物材料
正常及感染黑条矮缩病的水稻材料，均于2010年取自山东省农业科学院水稻研究所济宁水稻试验田自发病水稻植株，经液氮速冻后置于干冰内保存，带回实验室后迅速置于-70℃下保存备用。
12菌株及载体
大肠杆菌DH5α感受态购自Trangen公司；农杆菌LBA4404由本实验室保存；克隆载体pMD18-T购自Takara公司；植物表达载体pCA1300-Ubi为山东农业大学温孚江教授馈赠。
实验中使用的所有限制性内切酶、RNase A、Taq DNA Polymerase、T4 DNA ligase以及RNA反转录试剂盒Prime ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit （Code： D6110A）等均购自Takara公司（大连宝生物）；质粒提取试剂盒及凝胶回收试剂盒等购自天根生化科技有限公司（北京）；全氏金Trizol试剂（Code：ET101-01）购于济南雨同生物科技有限公司；氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）等抗生素均购自美国Amerisco公司；其他药品及试剂均为国产分析纯。
13感染RBSDV水稻叶片总RNA的提取及第一链cDNA的合成
利用传统Trizol法提取感染水稻黑条矮缩病毒水稻叶片的总RNA。
15病毒S6、S10干扰片段的获得
以感染RBSDV的水稻叶片总RNA反转录后的第一链cDNA为模板，利用片段 S6、S10的特异性引物进行PCR扩增，反应体系（25 μl）为：10×PCR buffer 25 μl、25 mmol/L dNTPs 1 μl、10 μmol/L上、下游引物各05 μl、单链cDNA 2 μl、Ex Taq DNA Polymerase 03 μl、ddH2O 182 μl；扩增条件为：94℃解链10 min；之后 94℃ 45 s， 56℃ 30 s， 72℃ 1 min， 共35个循环；最后72℃延伸10 min。最终获得了RBSDV S6、S10的DNA片段。获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，与克隆载体pMD18-T连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化细胞在LB平板上生成菌落，挑取部分菌落经菌液PCR鉴定，对可能的阳性菌落提取质粒，进一步用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切鉴定。对酶切鉴定阳性的重组质粒送山东省农科院高新技术研究中心测序室进行测序，将测序结果与NCBI网站上提供的序列应用DNAMAN软件进行核苷酸序列同源性比对。
16RNA干扰载体的构建
改造的载体pUC19由中国科学院遗传与发育研究所提供，在原有pUC19多克隆位点处插入一段两侧各含有一对同尾酶即BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ以及Sal Ⅰ和Xho Ⅰ的内含子片段，同尾酶方向相反。通过BamH Ⅰ和Sal Ⅰ分别将载体pMD18T-RBSDV-S6、pMD18T-RBSDV-S10中的干扰片段双酶切下来，将切下的目的片段回收，与用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ同样处理的pUC19干扰载体连接，并转化大肠杆菌DH5α，将得到的重组载体提取质粒后，经Pst Ⅰ单酶切检测，将上述得到的质粒进一步用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切，与经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切的载体pMD18T-RBSDV-S6、pMD18T-RBSDV-S10中的干扰片段连接，经转化大肠杆菌DH5α，得到重组载体，在此过程中外源插入的干扰片段通过两对同尾酶分别正向和反向构建入干扰载体中，且互补配对与内含子形成发夹结构，达到RNA干扰的目的，将构建成功的干扰载体分别命名为pUC19-RNAi-S6、pUC19-RNAi-S10。
17S6、S10干扰片段表达载体的构建
本研究所用的植物双元表达载体为山东农业大学温孚江教授馈赠的经改造的pCAMBIA1300载体，改造后该载体由玉米泛素Ubi启动子驱动，以生物安全性的bar基因作为选择标记，改造后载体命名为pCA1300-Ubi。将已构建入RNA干扰载体中的干扰序列的整体部分用Pst Ⅰ单酶切，进一步将其构建入双元表达载体pCA1300-Ubi中，转化大肠杆菌并挑取部分菌落进行菌液PCR鉴定，对可能的阳性菌落提取质粒，经Pst Ⅰ酶切鉴定后获得阳性重组质粒pCA1300-Ubi-RNAi-S6、pCA1300-Ubi-RNAi-S10。
18农杆菌介导的水稻遗传转化
将上步构建成功的RBSDVS6、RBSDVS10干扰片段的双元植物表达载体pCA1300-Ubi-RNAi-S6、pCA1300-Ubi-RNAi-S10用热激法转入农杆菌菌株LBA4404感受态中，经28℃培养两天获得单菌落，挑取部分单菌落经菌液PCR筛选鉴定，获得阳性克隆。将阳性克隆在培养基上划线后，挑取单克隆进一步培养获得菌液。
水稻转化品种为黄淮区主栽水稻品种圣稻13，水稻成熟胚遗传转化参照王薇[7]的方法进行。诱导出的水稻成熟胚愈伤组织与阳性农杆菌菌液共培养后，用10 mg/ml的Basta进行3次抗性筛选，经诱导及分化，获得部分转基因组培苗。
2结果与分析
21病毒S6、S10干扰片段的获得
以感染水稻黑条矮缩病的水稻叶片总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板，利用根据RBSDV双链RNA片段 S6、S10设计的特异性引物进行RT-PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳获得大小分别为276、244 bp的条带（如图1），与预期RBSDVS6、RBSDVS10相应条带大小一致，产物经回收并测序，与NCBI网站上提供的相应序列应用DNAMAN软件进行核苷酸序列同源性比对，相似性达到100%，证明为目的片段。
将回收后的片段连接入克隆载体pMD18-T并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化细胞在LB平板上生成菌落，挑取部分菌落经菌液PCR鉴定，对可能的阳性菌落提取质粒，进一步用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切鉴定，证明载体构建成功。
22pUC19-RNAi-RBSDVS6、pUC19-RNAi-RBSDVS10干扰载体的构建
干扰载体pUC19-RNAi中内含子的两端各含有一对同尾酶，即BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ以及Sal Ⅰ和Xho Ⅰ，且它们方向正好相反，这样就可以先通过BamH Ⅰ和Sal Ⅰ分别将载体pMD18T-RBSDV-S6、pMD18T-RBSDV-S10中的干扰片段双酶切下来，正向连入pUC19-RNAi载体，然后再用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切此干扰载体，将干扰片段反向连入，获得含有正反向S6、S10序列的RNA干扰载体（如图2）。
23pCA1300-Ubi-RNAi-RBSDV 系列植物双元表达载体的构建
经改造的pCambia1300表达载体添加了玉米泛素（Ubi）启动子来启动目的基因的表达，同时下游插入了由组成型35S启动子驱动的bar基因作为选择标记，重新命名为pCA1300-Ubi。将上述构建好的干扰载体中的正反向RBSDV干扰片段经PstⅠ单酶切克隆入pCA1300-Ubi载体中，重命名为pCA1300-Ubi-RNAi-S6、pCA1300-Ubi-RNAi-S10。以RBSDV片段S6为例，构建成功的表达载体图谱如图3。将构建好的双元表达载体分别经Pst Ⅰ酶切并电泳鉴定，获得酶切产物且大小均分别与预期相符合，证明载体构建成功（如图4）。
24农杆菌介导的水稻转化
将鉴定好的含目的干扰片段的系列双元植物表达载体pCA1300-Ubi-RNAi-S6、pCA1300-Ubi-RNAi-S10分别转入农杆菌LBA4404中，以转化的农杆菌菌液作为模板进行PCR扩增，鉴定目的片段是否成功转入。农杆菌菌液PCR鉴定结果如图5。
以鉴定为阳性的农杆品种菌单菌落进行液体培养获得菌液，以之侵染水稻品种圣稻13成熟胚愈伤组织，经共转化后，进一步经继代及Basta抗性筛选，获得转化植株。
3讨论
RNA干扰是指一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱导细胞表现出特定基因缺失的表型，因为这是一种在RNA水平的基因表达抑制，故称为RNA干扰（RNAi）[8]。实现RNA干扰的途径有多种，其中一种就是采用基因片段连接成反向重复序列的方法，使表达的单链RNA自我配对形成发夹结构RNA（hpRNA），发夹茎部形成稳定的dsRNA从而诱导同源的内源基因沉默。利用该原理可设计合成与病毒同源的dsRNA，针对靶标基因构建具有反向重复结构的沉默载体，转化植物后可形成dsRNA，引发植物体内的RNAi机制[9]，使靶标基因在转录后发生沉默，抑制病毒基因组的扩张。发夹结构导入植物后形成的dsRNA能实现RNA的稳定干扰，从而获得抗病毒的植物新品种。
RNAi技术应用于水稻抗病毒基因工程改良的研究已有许多成功的例证，Pinto等[10]将编码水稻黄斑病毒 （RYMV） 的一个关键酶基因转入水稻，诱发该基因沉默，从而培育成具有水稻黄斑病毒抗性的水稻抗病新品种，且该抗病性能稳定遗传3代。Zhou等[11]将RSV病毒外壳蛋白（CP）基因和特异蛋白（SP）基因组合到同一干扰载体中，将此干扰载体转化到易感品种中，纯合子第5代和第7代自交后表现出很强的抗病毒能力，而且RT-PCR结果显示，在转基因植株中病毒的CP和SP基因表达被显著抑制，且野生型和转基因植株在形态及发育上无明显差异，转基因植株产量较高、品质较好。梁国华等[12]利用水稻黑条矮缩病S8基因片段构建了RNA干扰载体转化水稻，获得了对水稻黑条矮缩病具有良好抗性的转基因水稻植株。
本研究以RBSDV病毒基因组中S6基因和S10基因作为靶基因，构建RNAi载体，其中S6全长为2 645 bp，含有一个开放阅读框，编码非结构蛋白P6，研究发现该蛋白具有RNA沉默抑制子的功能，并且在无其他病毒蛋白和RNAs条件下可以自我互作形成病毒粒子，在病毒的形态建成中发挥重要作用，该基因的有效沉默将影响病毒在作物体内的繁殖和扩增[13]。S10全长为1 801 bp，含有一个开放阅读框，编码病毒外层衣壳蛋白P10，P10具有自作用和低聚特性，通过N-端1～230个氨基酸的区域来实现自我的互作；其低聚物的形成需要依赖其他的病毒蛋白，从而形成水稻黑条矮缩病毒粒子的基础结构外壳[14]，该基因的有效沉默将影响病毒的形成，从而抑制病毒在作物体内的发展。
根据病毒基因组中不同基因设计的RNAi沉默载体转化水稻后获得的转基因植株对病毒的抗性存在差异。Shimizu等[15]研究发现针对RSV的pC3（编码核酸蛋白）基因和pC4（编码运动蛋白）基因构建的具有反向重复序列的RNAi载体转化水稻后可获得对病毒免疫的植株，而针对RSV pC2（编码糖蛋白，功能未知）基因和p4（编码主要非结构蛋白，功能尚不明确）基因设计的RNAi载体转化水稻后对病毒无抗性。这也说明了并不是所有针对病毒核酸的干扰载体在抗病毒方面具有同效作用。因此本实验前期工作中针对水稻黑条矮缩病毒不同dsRNA设计了一系列引物，目前已经获得了包括S6、S10在内的7个RBSDV干扰载体，并将它们分别转化黄淮稻区主栽水稻品种圣稻13成熟胚愈伤组织中，部分干扰载体已经获得了相应的转基因阳性材料，拟进一步对获得的材料进行抗病毒鉴定，为进一步筛选并培育抗病毒水稻植株提供候选材料。鉴于目前生产实践中还未发现具有抗水稻黑条矮缩病的相关种质资源，该方面的研究具有一定的实际意义及应用价值。参考文献：
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