材料。[方法]以pROKⅡ载体为骨架，利用In-Fusion连接方法构建由CaMV35S调控的小黑杨PnsICE1基因植物表达载体，用农杆菌介导法对拟南芥进行遗传转化。[结果]通过PCR检测，结果证明PnsICE1基因已整合到拟南芥基因组中，获得3株转PnsICE1基因拟南芥。[结论]植物表达载体的构建及转基因植株的获得为研究小黑杨PnsICE1基因功能提供材料。
关键词 小黑杨；PnsICE1；遗传转化
中图分类号 S181.3；Q782 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）04-047-03
低温伤害是世界上普遍存在的问题，也是造成农林业生产损失巨大的一种严重自然灾害[1]。研究并提高植物耐寒能力具有重要的理论意义和现实意义。随着生物技术的发展，导入外源基因提高植物抗逆性已成为现代植物育种的主要手段。ICE1（inducer of CBF expression1）也被称为诱导CBF表达基因，是能够调节冷诱导基因（cold-regulated，COR）表达的最上游转录因子。它编码一个类似转录激活基因（MYC）的bHLH 转录因子，在常温下钝化，在低温下能够特异地结合CBF3启动子中的MYC作用元件，诱导CBF3的表达，CBF3进一步结合到其下游目的基因启动子的DRE序列，诱导下游一系列冷诱导基因以及其他在植物寒冷适应中起作用基因的表达，继而提高转基因植株的抗寒性[2-4]。现已知转ICE1基因的拟南芥、柑橘、甜杨、苹果、大花蕙兰、水稻、烟草与非转基因植株相比，抗寒性都得到了提高[5-18]。笔者利用In-Fusion连接方法构建小黑杨PnsICE1基因植物表达载体，并转化拟南芥，获得T3代转基因拟南芥，为进一步研究小黑杨PnsICE1基因功能提供材料。
1 材料与方法
1.1 材料 哥伦比亚野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）：生态型Columbia（Col-0），种植于人工土（黑土∶蛭石∶珍珠岩= 3∶2∶1）中。
菌株与载体：大肠杆菌感受态（Esherichia coli）Top10 购自北京原平皓生物技术有限公司。根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105由黑龙江省林业科学研究所速生林木培育重点验室保存。pROKⅡ Vector 由山东农业大学惠赠。
高效连接试剂盒In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit、T4 DNA连接酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP Mixture、DNA分子量标准DL-2000均购自TaKaRa公司。
限制性内切酶均购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司公司（Promega， http：///）。
抗生素：利福平（Rifampicin，Rif）、羧苄青霉素（Carbenicillin， Cab）、乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）购自北京国药化学试剂有限公司（http：///），卡那霉素（Kanamycin，Kan）和氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）购自Sigma公司。
所用引物及测序委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成及完成（Sangon，http：///），引物序列：
PnsICE1-OE F：5′-TCGAGCTCGGTACCCATGCTTTATAGACTCAATAGC-3′；
PnsICE1-OE R：5′-CTCTAGAGGATCCCCCTACATCGCGCCATGGAAGCC-3′；
pROKⅡ F：5′-GGCGAACGTGGCGAGAAAGG-3′；
pROKⅡ R：5′-ACAGGTT-TCCCGACTGGAAAGC-3′。
1.2 PnsICE1基因植物表达载体构建 以之前获得的阳性克隆pMD18-T- PnsICE1质粒为模板，PnsICE1-OE F和PnsICE1-OE R为引物（下划线为引入pROKⅡ同源互补序列），利用PCR方法引入pROKⅡ质粒线性化末端的同源互补序列。PCR 扩增体系：DNA 2.0 μl，10×Ex Taq PCR buffer2.0 μl，10 mmol/L dNTP Mix 0.4 μl，10 μmol/L引物各1.0 μl，5 U/μl Ex Taq 0.2 μl，补水至20.0 μl。PCR反应程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性 10 s、58 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸2 min，共35 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μl PCR产物进行电泳检测，以DL2000 DNA Marker 为参照。回收PCR产物，用限制性内切酶SmaI对pROKⅡ vector进行单酶切。将目的基因（PnsICE1）片段与pROKⅡ vector的连接反应连接产物转化大肠杆菌，阳性克隆PCR检测。挑取阳性克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序成功的重组质粒转化农杆菌，进行农杆菌菌液检测。
1.3 浸花法转化拟南芥 采用蘸花法进行拟南芥的遗传转化[14]，将盛花期的拟南芥的花序浸泡在含有过表达质粒农杆菌的浸染液中[3%蔗糖、150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基（pH5.8），OD600≈ 0.2]10 s，期间轻轻摇动，取出后室温放置10 min，再侵染一次。侵染过的植株需保湿，48 h后用水喷雾将转化植株彻底清洗一次。21～28 d收集种子，加入适量变色硅胶保持干燥。标记为T0代，4 ℃保存。转基因拟南芥的T0代种子表面消毒后铺于含50mg/L Kan的筛选培养基上进行逐代筛选，直至获得T3代种子，利用pROKⅡ载体引物对筛选出的抗性苗进行PCR检测。
2 结果与分析
2.1 PnsICE1基因植物表达载体构建 以之前获得的阳性克隆pMD18-T-PnsICE1质粒为模板，PnsICE1-OE F和PnsICE1-OE R为引物，利用PCR的方法引入pROKⅡ质粒线性化末端的同源互补序列（图1A）。提取pROKⅡ质粒（图1B），用限制性内切酶SmaⅠ 对pROKⅡ vector进行单酶切（图1C）利用In-Fusion连接方法将质粒与目的片段相连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态，挑取3个单克隆进行初步的菌液PCR检测，获得一个阳性转化子，目的条带为1 600 bp左右（图1D），将通过菌落PCR验证目的片段正确的一个单克隆送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，经序列比对成功后，提取阳性质粒。将阳性质粒转化农杆菌，挑取5个单克隆将农杆菌菌液进行PCR检测，结果显示均为阳性转化子（图1E），保存菌种，用于下一步的拟南芥遗传转化。
2.2 PnsICE1基因过表达植物的鉴定 转基因拟南芥的T0代种子表面消毒后铺于含50 mg/L Kan的筛选培养基上（图2A），进行逐代筛选，直至获得T3代转基因拟南芥（图2B），利用pROKⅡ载体引物对筛选出的抗性苗进行PCR检测（图3），获得的3株转基因拟南芥均获得与阳性对照相同目的条带，而野生型对照植株未检测到目的条带，初步说明PnsICE1基因已整合到拟南芥基因组中。
3 讨论
构建林木重要基因植物表达载体并获得过表达植株继而研究其功能，对于阐明多年生木本植物抗寒调控的分子机制具有重要的理论意义。研究表明，植物ICEI转录因子在常温下钝化，在低温下能够特异地结合CBF3启动子中的MYC作用元件，诱导CBF3的表达，CBF3进一步结合到其下游目的基因启动子的DRE序列，从而诱导下游一系列冷诱导基因以及其他在植物寒冷适应中起作用的基因的表达，继而提高转基因植株的抗寒性[2-4]。该研究将之前从小黑杨中获得的pnSICE1基因利用In-Fusion连接方法成功构建植物过表达载体，并转化拟南芥，成功获得3株T3代转基因拟南芥，为进一步研究小黑杨PnsICE1基因功能、PnsICE1转录因子调控机制提供材料。
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