[摘要]目的：通过检测细胞表面黏附分子CD44v3和CD44v5在口腔黏液表皮样癌（Oral mucoepidermoid carcinoma，OMC）中的表达，探讨二者与OMC的发生、病理分级和临床分期的关系。方法：利用免疫组织化学方法检测40例OMC石蜡标本中CD44v3和CD44v5蛋白表达，并且分组进行统计学分析。结果：CD44v3和CD44v5在OMC中表达率与正常对照组相比有显著升高（P<0.05），不同病理分级、临床分期之间并无显著性差异（P>0.05）。结论：在OMC的淋巴结转移中，CD44v3和CD44v5可能起着重要作用，CD44v3、CD44v5可能成为了解OMC病变发生发展生物学行为及淋巴结转移重要的生物学指标之一。
[关键词]口腔黏液表皮样癌；CD44v3；CD44v5；免疫组化
[中图分类号]R739.85 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2015）04-0032-03
Expression and clinical significance of CD44v3 and CD44v5 in oral mucoepidermoid carcinoma
MA Zuo1，HU Shan-shan2，ZHOU Yang1，SUN Hao-liang1，LI Hui1，LI Qiao-ling1
（1.Department of Stomatology，2.Department of Ophthalmology，Red Flag Hospital，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，Heilongjiang，China）
Abstract： Objective To detect the expression of the cell surface adhesion molecule CD44v3 and CD44v5 in oral mucoepidermoid carcinoma（OMC），and to explore the relationship between the two and the occurrence，pathological grade and clinical stage of OMC. Methods Immunohistochemical staining was used to detect the exprssion of CD44v3 and CD44v5 protein in 40 cases of OMC in paraffin embedded specimens， and were statistically analyzed. Results CD44v3 and CD44v5 expression rates in OMC compared with the control group was significantly higher （P<0.05）， no significant differences between pathological grade， and clinical stage （P>0.05）. Conclusion OMC in the lymph node metastasis，CD44v3 and CD44v5 may play an important role，CD44v3，CD44v5 may be one of the important indexesto understand the transfer of OMC lesion development and the biological behavior of lymph node.
Key words：oralmucoepidermoid carcinoma；CD44v3；CD44v5；immunohistochemistry
口腔黏液表皮样癌（Oral mucoepidermoid carcinoma，OMC）是临床十分常见的口腔恶性肿瘤之一[1]，临床研究表明其细胞学行为与肿瘤的生物学行为高度相似。临床上将这一类广泛分布的细胞表面黏附分子均称为CD44，由于CD44亚型是拼接有外显子的变异亚型码，因此研究人员将CD44家族中含有变异型外显子v3和v5编码序列的CD44分子依次命名为CD44v3和CD44v5，且其多在上皮源性或肿瘤细胞中表达，故临床报道较多，报道多集中讨论于其与胆囊癌、肾癌、非小细胞肺癌、肠癌以及口腔鳞状细胞癌等癌症的相关性[2-3]。通过以CD44v为关键词搜索国内外相关文献，发现其中关于CD44v3和CD44v5与口腔黏液表皮样癌的报道十分罕见，但相关学者的研究表明CD44v3和CD44v5对口腔黏液表皮样癌的诊断和治疗具有一定的临床价值[4]。故本课题应用免疫组织化学方法对CD44v3和CD44v5在OMC中的表达进行检测，并探讨两者表达的临床意义。
1 材料和方法
1.1 材料
选取2009年-2014年在牡丹江医学院附属红旗医院治疗的40例口腔黏液表皮样癌患者为研究对象，纳入标准：①均经病理切片确诊；②病理科均有带有癌旁组织的原发口腔黏液表皮样癌蜡块存档；③所有患者均仅实施手术治疗；④所有患者均未于术前接受放疗等辅助性治疗措施。其中男26例，女14例；年龄28～79岁，平均年龄（45±6）岁。依据2005年世界卫生组织制定的有关口腔黏液表皮样癌病理分级标准对所有患者进行病理分级。同时，选取同时期的10例正常涎腺组织作为对照组。
1.2 试验方法
1.2.1 试剂：本研究以免疫组织化学方法检测样本组织中的CD44v3及CD44v5表达，检测所需的CD44v3抗体、CD44v5抗体、免疫组化试剂盒均购自福州博尔生物技术开发公司。
1.2.2 免疫组化染色：①采用二甲苯进行蜡切片脱蜡，并以梯度酒精充分脱去样本中的水分，充分脱水后采用清水及封闭液冲洗10min，并采用柠檬酸高压修复样本，持续2min；②以PBS缓冲液冲洗样本3min，并反复冲洗3次，冲洗后于每份样本中加入50μl一抗，并将处理的样本置于4℃试验箱恒温过夜；③将样本取出，并用PBS缓冲液持续冲洗5min，并连续冲洗3次，冲洗完成仔细吸除样本表面残留的PBS缓冲液，并在每份样本中滴加50μl 放大剂（鼠或兔），室温孵育10min；④用PBS缓冲液持续冲洗样本3min，并连续冲洗3次，冲洗完成仔细吸除样本表面残留的PBS，并在每份样本中滴加50μl多聚酶结合物，于室温下持续孵育10min；⑤用PBS缓冲液持续冲洗样本3min，并连续冲洗3次，冲洗完成仔细吸除样本表面残留的PBS缓冲液，并在每份样本中滴加50μl新鲜配制的DAB溶液，并将样本置于显微镜下仔细观察3～5min，用自来水反复冲洗样本后，用苏木素对样本进行复染，采用0.1% HCl分化样本，并用氨水将样本返蓝；⑥采用梯度酒精充分脱去样本中的水分并干燥后，采用透明二甲苯中性树胶将样本封固。
1.3 结果判定标准
本研究采用双盲法进行结果判定，所有样本均由两名病理学专业人员对样本进行阅片和计数。阳性样本特征：CD44v3及CD44v5蛋白均为棕黄色，且因具有定位于细胞膜表面的特性，故多以连续的棕黄色线状或者带状分布于阳性细胞周围[5]。阅片人员随即选取10个高倍视野进行观察，当细胞膜表面出现完整的色板时则视为阳性样本，仔细分辨并记录该视野下阳性细胞所占细胞总数的百分数（%）。样本阳性诊断标准：①膜染色较间质背景染色深，②细胞染色数量≥5%即为阳性。采用半定量积分法进行结果判断，阅片人员应以染色较好的10个高倍视野进行评分，评分标准如下：①计数着色细胞比例，l/3以下为1分，1/3～2/3为2分，2/3以上为3分；②计数着色程度，无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；③将同一样本的上述两种计分结果相乘，a.0分则为阴性（-）；b. 1～4分则为弱阳性（+）；c.>4分则为强阳性（++）。
1.4 统计分析
所得数据采用SPSS13.0统计软件，计数用χ2检验或校正χ2检验或Fisher精确检验以及Spearman等分析，当P<0.05时，差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 OMC分化程度与CD44v3、CD44v5表达相关性分析
OMC分化程度依次为高、中、低的患者中，CD44v3阳性率依次为45.5%、61.6%、81.3%，故随着OMC分化程度增高，CD44v3表达率依次下降，其两者间未呈明显的正相关性（P>0.05）；OMC分化程度依次为高、中、低的患者中，CD44v5阳性率依次为45.5%、69.2%、87.5%，由表1可看出，CD44v3在高、中、低分化中OMC的表达随着分化程度越低其阳性率上升，故随着OMC分化程度增高，CD44v5表达率依次下降，但其表达与OMC分化程度无明显关系。CD44v5在高、中、低分化中OMC的表达阳性率分别为45.5%、69.2%、87.5%，且两者间未呈正相关性（P<0.05），详细数据请见表1。
2.2 OMC患者中CD44v3、CD44v5表达的相关性分析
在28例CD44v3阳性表达OMC标本中，有26例样本同时为CD44v5阳性表达，约占样本总数的92.8%；在15例CD44v3阴性OMC标本中，有11例样本同时为CD44v5阴性表达，约占样本总数的73.3%；Sperman分析结果表明两者之间呈正相关（R=0.724，P<0.01），详细数据请见表2。
2.3 OMC淋巴结转移与CD44v3、CD44v5表达相关性分析
由表3可知，伴有淋巴结转移的OMC样本中CD44v3及CD44v5阳性表达率依次为72.4%、79.3%，均明显高于无淋巴结转移样本中的18.1%（P<0.05）、18.1%（P<0.01），差异均具有统计学意义，详细数据请见表3。
3 讨论
临床研究表明，11号染色体短臂（p14-13）上存在着细胞膜表面糖蛋白被单基因编码的CD44分子。由于CD44基因外显子不同的表达方式，导致了蛋白质的不同类型，这两种外显子被称为标准型CD44S和变异型CD44v[6]。
最新临床研究结果表明，CD44v可通过以下几种机制促进肿瘤的生长及转移：①促进高内皮小静脉与淋巴细胞结合；②对淋巴细胞归巢或激活具有正性作用[7]；③能够促进淋巴组织再循环；④参与并促进淋巴细胞粘附于内皮细胞的过程；⑤自身是周围细胞或细胞间质的组成成分之一；⑥具有类似纤维连接蛋白、透明质酸、硫酸软骨素等的粘附作用；⑦可直接参与肿瘤的转移、离肝素结合因子的产生和透明质酸的降解[8-10]。
研究人员发现CD44v3和CD44v5两种亚型的阳性表达产物均为棕黄色颗粒，结合本研究结果以及相关文献可知，CD44v3多高表达于OMC组织，而低表达于正常口腔黏膜；但CD44v5却多高表达于正常口腔黏膜，而低表达于OMC组织。此外，CD44v3和CD44v5与不同病理分级的OMC组织中表达强度均不存在明显的统计学差异（P>0.05）。
本研究通过对我院40例OMC患者样本分析表明，OMC不同病理分级患者间以及OMC淋巴转移患者以及为转移患者间CD44v3和CD44v5的表达率均具有统计学差异（P<0.05），且OMC淋巴转移患者表达率高于未转移患者，结果表明CD44v3及CD44v5阳性表达率和OMC的转移呈一定的正相关性。上述结果为临床判断OMC是否发生了淋巴转移提供了更可靠的实验依据。今后的试验将在扩大样本例数的基础上，结合更精确的判断标准，进行更深入的研究。同时可更细致的分析CD44v3及CD44v5阳性表达量在OMC诊治中的临床价值。
[参考文献]
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[收稿日期]2014-11-28 [修回日期]2015-01-22
编辑/张惠娟
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