地黄类RghBNG基因的克隆与生物信息学分析

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 地黄 品种温85-5，由温县农业科学研究所提供。

1.1.2 试剂和仪器 大肠杆菌DH5α菌株、LA Taq DNA聚合酶、克隆载体pMD19-T Vector、RNA提取主要试剂、DNA凝胶回收试剂盒、DNA Marke、反转录试剂盒、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、NaCl、NaOH、氨苄青霉素、CaCl2、琼脂糖甘油、SanPrep 柱式DNA胶回收试剂盒。灭菌锅、天平、移液枪、水浴锅、离心机、超微量分光光度计、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析系统、制冰机、蛋白电泳设备、超低温冰箱、超净工作台、HZQ-X100型振荡培养箱、LRH-250A型生化培养箱。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成以及目的基因PCR 根据已经报到的地黄RgBNG基因的碱基序列[11]，使用Primer 5.0软件合成引物：上游引物F（5′-CGCGGATCCATAATGGCTTCATCCACC-3′），下游引物R （5′-CCGCTCGAGCAGTAAAGCATTCATCTC-3′），用RT-PCR技术扩增目的基因片段，DNA凝胶回收试剂盒对其进行回收和纯化，测序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.2 基因序列的生物信息学分析 基于克隆cDNA序列，利用NCBI的ORF Finder软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析基因的开放阅读框，并进行蛋白质翻译；利用ExPASy软件中的ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析该基因编码蛋白质的氨基酸的组成、等电点、分子量、负电荷残基、正电荷残基等；利用SOPMA软件（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl？page=NPSA/npsa sopma. html）进行该基因编码蛋白质二级结构的预测和分析；利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/进行该基因信号肽的预测；利用Profun 2.2 Server软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun）进行该基因蛋白质功能的预测；利用TMpred工具（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）预测跨膜区和跨膜方向。

2 结果与分析

2.1 类RgBNG基因的RT-PCR扩增

利用RT-PCR技术扩增地黄类RgBNG基因，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增出5条条带（图1）。

2.2 地黄类RghBNGL基因的克隆和测序

从图1中回收和纯化1、2条带，与pMD19-T载体在4 ℃下连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经过蓝白斑筛选，挑取阳性单菌落进行PCR检测。将检测为阳性菌落的悬液送去生工生物工程（上海）股份有限公司测序，结果表明条带1为大小为1 974 bp，命名为类RghBNGL基因，而条带2大小为548 bp，为RghBNG基因。

2.3 地黄类RghBNGL基因的生物信息学分析

2.3.1 地黄类RghBNGL基因的ORF分析 利用ORF Finder软件对地黄类RghBNGL基因1 974 bp的碱基序列进行分析，找到1个486 bp的开放阅读框，编码161个氨基酸（图2）。

2.3.2 地黄类RghBNGL基因编码氨基酸的一级结构预测 利用ExPASy中ProtScale分析该基因编码蛋白的氨基酸的组成、等电点、分子量、负电荷残基等，并对其一级结构进行预测，结果如表1所示。

利用SOPMA软件进行该基因编码蛋白质二级结构的预测和分析（图3、表2），结果显示延伸链所占的比例最高为34.78%，其次是无规则卷曲，所占比例为33.54%，还有α-螺旋所占比例为21.74%，最低的是β-螺旋，所占比例为9.94%。

2.3.3 地黄RghBNGL蛋白质疏水性/亲水性分析 地黄RghBNGL蛋白质疏水性/亲水性的分析结构如图4所示。第71位具有最高分值，为3.512，疏水性最强；第129位具有最低分值，为-3.056，亲水性最强。GRAVY值为0.242，所以推测地黄RghBNGL蛋白质是一种疏水蛋白质。

2.3.4 地黄RghBNGL蛋白质的功能预测 地黄类RghBNGL蛋白的功能预测结果（表3）表明，该蛋白质的最主要功能指向脂肪酸新陈代谢，也可能参与了翻译等过程。

2.3.5 地黄类RghBNGL蛋白质跨膜区分析 利用TMpred工具预测地黄类RghBNGL蛋白质可能的跨膜螺旋区和跨膜方向，结果如图5所示，有两个可能的跨膜区，第一个模型是从外到内的，氨基酸的起始位置分别为39、58、87，终止的位置分别为56、76、105，长度分别为18、19、19，分值分别为1 549、 2 107、999（图5）。

3 小结与讨论

分离与克隆功能基因是研究基因的结构、功能、表达调控以及分子机理的基础，也是生命科学研究的重点之一。RT-PCR是分离与克隆功能基因的有效方法，具有快速、简便、特异性强等优点。研究者采用RT-PCR技术已经成功克隆了多种植物的多个基因[10，13，14]，比如侯嵘等[15]克隆了麻疯树鲨烯合酶基因SQS；徐大伟等[16]克隆了棉花八氢番茄红素脱氢酶GhPDS1基因；任磊等[17]克隆了牡丹开花相关基因PsAP1；Padilla等[18]克隆了橄榄的6-脂氧合酶基因。本研究根据克隆的地黄类RghBNG基因序列设计引物，利用地黄RNA作模板，采用RT-PCR进行扩增，结果出现5条条带，对其中最大条带的类RghBNG基因生物信息学进行分析，发现其包含1个编码161个氨基酸的开放阅读框，为疏水性非分泌型碱性蛋白质，参与脂肪酸新陈代谢和蛋白质合成，为进一步研究其蛋白质基因结构、功能和调控以及应用奠定了基础。

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