[摘要] 目的 研究结节性红斑患者与健康对照人群外周血单核细胞中Toll样受体9（TLR9）和核因子-κB（NF-κB）的表达情况，并分析其在结节性红斑中的临床意义。 方法 选择2014年6月～2017年10月山东省威海市妇幼保健院及山东省威海市立医院确诊的结节性红斑患者52例作为疾病组；另选健康体检者41名作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血单核细胞中TLR9和NF-κB的mRNA水平。 结果 疾病组外周血中TLR9 mRNA水平较对照组明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01），疾病组NF-κB mRNA水平较对照组明显升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。疾病组中TLR9与NF-κB的mRNA水平存在线性正相关关系（r = 0.89，P < 0.01）。 结论 与正常人群相比，结节性红斑患者TLR9 mRNA水平明显降低，NF-κB mRNA水平明显升高，提示TLR9和NF-κB可能参与了结节性红斑疾病的发病过程。
[关键词] 结节性红斑；外周血；Toll样受体9；核因子-κB
[中图分类号] R275.986.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（b）-0106-03
[Abstract] Objective To study the expression of Toll-like receptor 9 （TLR9） and nuclear factor-κB （NF-κB） in peripheral blood mononuclear cell of erythema nodosum patients and healthy controls and to explore the clinical significance of TLR9 and NF-κB in erythema nodosum. Methods From June 2014 to October 2017， 52 patients with erythema nodosum from Weihai Women and Children′s Hospital and Weihai Municipal Hospital of Shandong Province were eolled as disease group， and 41 healthy physical examinees served as control group. The mRNA levels of TLR9 and NF-κB in peripheral blood mononuclear cell were detected by real-time fluorescence quantitative PCR technique. Results The level of TLR9 in disease group was lower than that of control group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The level of NF-κB in disease group was higher than that of control group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. In disease group， there was a positive linear correlation between TLR9 mRNA and NF-κB mRNA （r = 0.89， P < 0.01）. Conclusion Compared with normal people， the level of TLR9 mRNA in erythema nodosum patients is significantly decreased， while the level of NF-κB mRNA is significantly increased， suggesting that TLR9 and NF-κB may play an important role in the occurrence and development of erythema nodosum.
[Key words] Erythema nodosum； Peripheral blood； Toll-like receptor 9； Nuclear factor-κB
結节性红斑（erythema nodosum，EN）是临床常见的一种病因复杂并易反复发作的炎症性皮肤病，病理表现为间隔性脂膜炎，主要临床表现为双小腿伸侧疼痛性、对称性红色结节，结节为非溃疡性，可自行消退，青年女性好发[1]。EN确切的发病机制目前尚不明确，其发生可能是机体对某些病原微生物抗原的一种迟发型超敏反应，也可能是一种免疫复合物疾病[2]。人类Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是近年来发现的一类新的细胞表面信号传导跨膜受体，是人体固有免疫和适应性免疫的桥梁，是一种机体通过感知微生物病原体直接作出防御反应的天然免疫受体，TLR9是TLR家族的重要成员，能识别多种微生物的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），通过刺激信号的级联反应诱导炎症介质和炎性细胞因子的产生，从而参与多种感染性疾病的进展[3]。核因子-κB（NF-κB）是一种重要的转录调控因子，在免疫应答中发挥重要作用，主要是通过与启动子及增强子的作用，从而促进多种免疫细胞及细胞因子的活化。TLR9和NF-κB是否参与了EN的发生发展，国内外鲜见相关报道。本研究通过检测EN患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中TLR9和NF-κB的表达，探讨TLR9和NF-κB在EN发病机制中的可能作用，为深入开展EN免疫相关研究提供依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2014年6月～2017年10月山东省威海市妇幼保健院、山东省威海市立医院皮肤科门诊及住院患者52例为疾病组，其中男13例，女39例；年龄19～51岁，平均（29.4±5.8）岁；病程1 d～10年，平均（1.3±0.6）个月；轻型13例，中型34例，重型5例。另收集上述两所医院的健康体检者41名为对照组，其中男17名，女24名，年龄20～52岁，平均（30.4±5.2）岁。两组年龄、性别差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
纳入标准：所有患者均具有典型临床表现，皮肤组织病理学检查符合EN，诊断及分型符合文献诊断分型标准[4]。排除标准：①1个月内系统应用糖皮质激素、免疫调节剂或抗组胺药物；②肝肾功能异常；③糖尿病、系统性红斑狼疮、心血管病、严重肝肾功能损伤性等系统疾病；④麻风EN；⑤妊娠及哺乳期妇女。所有研究对象均知情同意并签署知情同意书，本研究获医院医学伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 分离PBMC 收集患者及健康体检者静脉血2～3 mL，肝素抗凝管保存，淋巴细胞分离液密度梯度离心法（2000 r/min，离心半径15 cm，离心5 min）分离PBMC，放置-80℃冰箱保存备用。
1.2.2 测定PBMC中TLR9及NF-κB水平 將PBMC复融并平衡至室温，加入1.5 mL RNAiso Plus（总RNA提取试剂，大连宝生生物公司，批号：16105）提取总RNA。用Real-time PCR（杭州博日科技有限公司，扩增仪型号：LineGene 9600 series）检测TLR9及NF-κB mRNA表达量。按试剂盒（美国Thermo公司，DRR037A，批准文号：0020150918）说明，参照Genbank中目的基因mRNA序列设计相关引物（引物由上海生工生物工程有限公司合成），见表1，反应条件为45℃预变性60 min，70℃变性5 s，4℃退火5 h，共运行45个循环。
1.3 统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料以例表示，采用χ2检验，相关性分析应用Pearson分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组外周血TLR9和NF-κB的mRNA水平比较
疾病组TLR9 mRNA水平明显低于对照组，NF-κB mRNA水平明显高于对照组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。
2.2 两组中TLR9与NF-κB相关性分析
疾病组中TLR9与NF-κB存在线性正相关关系（r = 0.89，P < 0.01）。
3 讨论
EN是一种以双下肢疼痛性红斑为主要临床特征的炎症性皮肤病[5]，其病因复杂，主要包括感染、特发性、药物、自身免疫性疾病、肿瘤、妊娠等[6]。目前主要诊断依据是临床表现和组织病理学诊断，其中组织病理学的主要表现为间隔性脂膜炎。EN发病机制多样，可为一种独立的皮肤病，也可为其他疾病的皮肤表现，临床上需要根据临床表现、病史和实验室检查进行综合诊断[7]。张琛等[8]认为病原微生物感染人体诱导疾病发生，从而引起机体免疫功能紊乱是发病的主要原因，其中免疫机制在EN发生和发展中起重要作用。谭自明等[9]对27例EN患儿的病因及免疫特点进行分析，发现细胞免疫紊乱可能在EN发病过程中起到重要作用。陈丽莉等[10]通过研究EN患者皮损处CD4、CD8表达情况，发现疾病组CD4阳性表达率明显高于正常组，CD8阳性表达率与正常组相比无统计学差异，说明CD4+T细胞在EN皮损的发病过程中起重要作用，从而提示EN患者皮损处存在着T淋巴细胞亚群的失衡。
研究表明，TLRs在机体感染防御中起重要作用，是机体抵抗感染的第一道屏障[11-12]。TLRs能够识别自身RNA和DNA而引起自身免疫性疾病[13]，如血管炎中可通过活化和调节获得性免疫应答促进疾病的发生发展[14]。韩晨珠等[15]发现结节性红斑患者皮损处人类白细胞DR抗原（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）分子高表达，间接证实T淋巴细胞介导的细胞免疫反应在EN的发生、发展中起重要作用。作为TLR家族成员之一，TLR9表达于免疫细胞，在PBMC中，主要表达TLR9的细胞是浆细胞来源的树突状细胞和B细胞[16]，通过与细菌DNA作用而诱导机体的固有免疫反应。研究表明TLR9参与感染过程，主要是通过识别细菌或病毒上未甲基化的CpG序列完成[17]。TLR9活化的信号传导属于典型的Toll样受体信号通路，可以启动经典的NF-κB途径，产生大量炎性细胞因子，帮助机体抵御感染等致病因素[18]。TLR9能够直接参与抵抗病原微生物的侵袭，同时也可以通过释放特异的炎症介质和启动相应免疫细胞，从而在免疫应答中发挥重要作用[19]。也有研究发现，激活TLR9可诱导人B淋巴细胞表面活化因子（B-cell activating factor，BAFF）的表达，进一步促进BAFF的增殖，从而推测激活人B淋巴细胞表面的TLR9在自身免疫性疾病发病机制中发挥了重要的作用[20]。
目前对于TLR在EN患者中的表达及相关性报道很少，由于TLR9、NF-κB在感染和疾病免疫中的重要作用，深入研究TLR9、NF-κB在EN患者外周血中的表达，有助于EN发病机制的进一步明确。本研究通过对EN患者与健康人群进行对比研究，发现疾病组TLR9 mRNA水平较对照组明显降低（P < 0.01），疾病组NF-κB mRNA水平较对照组明显升高（P < 0.01），提示EN疾病的发生可能与TLR介导的相关信号传导产生炎性因子有关，其可能的机制为当TLR9被细菌或病毒等配体激活后，经多步反应，导致NF-κB等转录因子转核，共同参与固有免疫应答，对了解EN患者PBMC中TLR9和NF-κB的表达率和定量表达水平的差异有重要意义，同时能进一步证实本病的发生与感染的密切关系。本研究还发现疾病组PBMC中TLR9和NF-κB的mRNA水平具有线性正相关关系，因此我们推测在EN发病过程中，内源性或外源性因素使得机体免疫上游的TLR9、NF-κB被激活，引起炎症介质，包括细胞因子、自由基等的释放，引起补体级联反应，打破机体的免疫耐受，导致EN的发病。
综上所述，TLRs在EN患者发病过程中具有极其重要的作用，TLR9、NF-κB可能是EN发病的重要免疫调控因素之一，也可能对EN患者感染的发生和控制有着重要的介导作用，严密监测EN患者外周血中TLR9及NF-κB的mRNA水平变化，对本病的诊疗具有重要的诊断价值，从而为EN患者疾病的预防与感染的控制开辟新的思路。本研究样本量较少，可能造成实验结果的局限性，后续仍需进行大样本量的实验进一步证实。
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（收稿日期：2018-04-02 本文编辑：张瑜杰）
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