杆状病毒表达系统制备的重组禽腺联病毒的鉴定

计划（编号：BE2013415）;江苏省六大人才高峰项目（编号：NY-009）。

作者简介：崔潇婷，女，江苏如皋人，讲师，主要从事兽用生物制药的研究。E-mail：419445466@qq.com。

通信作者：王安平，博士，副教授，主要从事兽用生物制药的研究。E-mail：wap4017@163.com。

腺联病毒（adeno-associated virus，AAV）又称腺病毒相关病毒，作为一种新型的病毒载体，与其他重组病毒载体相比较，具有对宿主没有致病性、免疫原性极低、宿主范围广、表达时间持久等优点[1]，因此被认为是一种比较理想的基因转移载体，目前广泛地用于基因治疗和基因工程疫苗等方面的研究。rAAV已有效地转导了小鼠和灵长类动物的多个组织和细胞，并能介导外源基因在肺脏、中枢神经系统、肝脏、视网膜及骨骼肌等器官和组织中的长期表达[2-6]。

禽腺联病毒（avian adeno-associated virus，AAAV）于1973年由Yates等首次发现并报道[7]，AAAV的理化性质、基因组结构等与AAV基本相似，提示可作为有潜力的重组病毒载体开发应用[8-9]。目前，重组禽腺联病毒的制备方法主要是三质粒共转染法，即将顺式（携带ITR 和外源基因）、反式（编码rep和cap）和辅助基因的3 种质粒共同转染293细胞系，这种方法成本偏高、程序较繁、不宜扩大生产，且获得的重组禽腺联病毒滴度偏低。2002年，Masahi 等发现Rep78在昆虫细胞Sf9中无需辅助病毒或质粒就能支持AAV DNA复制[10]，将重组杆状病毒/昆虫细胞系统应用于rAAV的生产，这种方法克服了传统三质粒法的技术难关，rAAV滴度大大提高，生产出的rAAV与使用293细胞生产得到的病毒载体在生物功能上没有差异，杆状病毒/昆虫细胞悬浮生产系统被证明是一种简单、高效、经济的可以大规模生产的方法。

本实验室首次利用重组杆状病毒/昆虫细胞系统制备rAAAV的生产，本研究对昆虫细胞制备的rAAAV进行以系列的鉴定，为rAAAV的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体和细胞

含GFP报告基因及AAAV两侧末端重复序列的重组杆状病毒rBac-GFP，表达AAAV结构蛋白的重组杆状病毒rBac-VP，表达AAAV功能蛋白的重组杆状病毒rBac-Rep均由笔者所在实验室构建并保存;Sf9细胞购自Invitrogen公司;鸡胚成纤维细胞（CEF）用9～11日龄SPF鸡胚制备;鸡胚肝细胞系（CEL）由中国农业科学院生物制品工程技术中心提供。

1.2 工具酶和试剂

昆虫细胞培养基Sf-900ⅡSFM（Serum free medium），购自GBICO公司;HRP标记的羊抗鼠IgG，购自康为世纪生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯级。

1.3 rAAAV-GFP的制备

参照文献[11]的方法，将Sf9昆虫细胞以5×105 cells/mL 的初始密度接种于摇瓶中的昆虫细胞培养基，110 r/min 27 ℃振摇培养，至密度达2×106 cells/mL时，以MOI为5，接种3种重组杆状病毒rBac-GFP、rBac-VP、rBac-Rep。3 d后，离心收集细胞沉淀，于-80 ℃、37 ℃反复冻融3～5次，12 000 r/min离心10 min，收集上清，即为含GFP报告基因的重组禽腺联病毒rAAAV-GFP。

1.4 rAAAV-GFP的纯化

将以上制备的病毒液先用0.22 μm的滤膜过滤，除去杂质和大分子蛋白，再加入1/10体积的氯仿在摇床上室温剧烈振摇1 h，加入5 mol/L NaCl至终浓度为1 mol/L，12 000 r/min 离心10 min，取上层水相，加入PEG 8000至终浓度为10%，冰浴 1 h，12 000 r/min离心15 min，PBS溶解沉淀，即为纯化的rAAAV-GFP。

1.5 rAAAV-GFP的电镜鉴定

将纯化的重组病毒rAAAV-GFP滴加于铜网上，经2%磷钨酸负染后，在投射电镜下观察。

1.6 rAAAV-GFP的Western blot分析

取少量的rAAAV-GFP純化产物，与等体积的2×loading buffer混匀后，煮沸3 min，取15 μL进行SDS-PAGE分析，以未接种病毒的细胞沉淀作为阴性对照。样品电泳结束后转印PVDF膜，以鼠抗VP3多抗作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠作为二抗，按常规方法进行Western blot分析。

1.7 rAAAV-GFP的体外表达试验

分别将CEF细胞和鸡胚肝CEL细胞系按1×105 cells/孔接种24孔培养板，37 ℃、5% CO2培养24 h后，吸弃培养液，将rAAAV-GFP以10倍倍比稀释感染细胞，24 h后，在荧光倒置显微镜下观察荧光出现的时间、数量及持续时间。

2 结果与分析

2.1 rAAAV-GFP的纯化

为建立简单有效的病毒纯化方法，将含有重组病毒的细胞裂解上清液分别经滤膜过滤、氯仿抽提以及PEG沉淀。SDS-PAGE对纯化产物进行分析，由图1可知，经一系列纯化步骤后，大量的杂蛋白被去除，重组病毒得到了较好的纯化。

2.2 rAAAV-GFP的电镜鉴定

纯化的病毒液负染后电镜下观察，可见大小为25 nm左右的二十面体样的病毒粒子，并有空心和实心之分，与野生AAAV病毒粒子的大小和形态相似（图2）。

2.3 rAAAV-GFP的Western blot分析

为鉴定rAAAV的结构蛋白组成，将纯化的病毒液进行Western blot分析，以VP3多抗血清作为一抗，结果可见3个结构蛋白，与野生病毒结构蛋白分子量相近（图3）。

2.4 rAAAV-GFP的体外表达试验

为探讨昆虫细胞制备的rAAAV-GFP的生物学特性，将rAAAV分别感染鸡胚成纤维细胞CEF和鸡胚肝细胞系CEL，荧光显微镜结果显示，在感染后约24 h可见绿色荧光，随着时间推移，荧光逐渐增强，时间可持续至试验结束（图4），说明rAAAV能介导GFP基因在鸡细胞中高效稳定表達。

3 讨论

家禽生产预防疾病主要靠疫苗的研发，而新型疫苗的研发又依赖于病毒转移载体， 目前许多家禽病毒被开发为载体

进行应用，如新城疫病毒、禽流感病毒、马立克氏病毒等，这些病毒载体存在着一些缺点不能广泛应用，如操作繁琐、费用昂贵、难以大规模生产等[12-14]。近年来，对腺联病毒的研究越趋成熟，作为一种良好的基因转移载体被广泛使用。禽腺联病毒由于无致病性，是一种良好的家禽基因转移载体，但其研究却相对滞后。

为提高rAAV的滴度，建立简便高效的rAAV生产方法，研究者们作出了不断努力，如建立表达Rep、VP基因的细胞系、利用HSV-1作为辅助病毒等，其中最为成功的是利用昆虫细胞系制备rAAV。目前，制备rAAAV的方法仍然是传统的三质粒共转染法，笔者所在实验室首次尝试利用杆状病毒表达系统制备rAAAV。

本研究对该系统制备的rAAAV进行一系列的鉴定，首先将昆虫细胞制备的重组病毒进行纯化，SDS-PAGE结果显示，建立的滤膜过滤、氯仿抽提、PEG沉淀的方法能有效纯化重组病毒;电镜结果可见重组病毒粒子，大小为20 nm左右，与AAAV粒子大小、结构相似;Western blotting结果揭示，重组病毒由3 个结构蛋白组成，均能被AAAV VP3特异识别，且大小与AAAV的3个结构蛋白相近;体外细胞感染试验证明，rAAAV具有与三质粒共转染法制备的rAAAV相似的生物学功能，能成功感染鸡成纤维细胞、鸡肝细胞等，并能介导GFP表达长达2 周之久。以上结果说明，杆状病毒系统制备的rAAAV具有与野生病毒相似的理化特征，且能介导外源基因在鸡细胞中长期稳定表达，为rAAAV的进一步应用奠定了基础。

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