姜黄素对THP-1源性巨噬泡沫细胞B类1型清道夫受体表达的影响

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[摘要] 目的 研究姜黄素对人单核细胞（THP-1）源性巨噬泡沫细胞B类1型清道夫受体（SR-B1）表达的影响。 方法 使用不同浓度姜黄素（12.5、25、50 mg/L）作用于THP-1巨噬泡沫细胞，观察三组不同浓度姜黄素作用的THP-1源性巨噬泡沫细胞SR-B1表达情况。 结果 仅50 mg/L姜黄素作用24 h细胞存活率低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;其他浓度及时间姜黄素组细胞存活率与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。50 mg/L姜黄素组SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表达水平明显低于其他组，差异有统计学意义（P<0.05）;25 mg/L姜黄素组上述指标表达水平低于12.5 mg/L姜黄素组和对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;12.5 mg/L姜黄素组与对照组上述指标表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 一定浓度姜黄素可抑制THP-1源性巨噬泡沫细胞中SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA的表达，从而减少泡沫细胞，达到抗动脉粥样硬化的目的。

[关键词] 姜黄素;THP-1源性巨噬泡沫细胞;SR-B1

[中图分类号] R543.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）07-0026-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of curcumin on the expression of class B type 1 scavenger receptor（SR-B1）in human monocyte-derived（THP-1）-derived macrophage foam cells. Methods Different concentrations of curcumin（12.5， 25， 50 mg/L） were used to treat THP-1 macrophage foam cells， and the expression of SR-B1 in THP-1 derived macrophage foam cells treated with different concentrations of curcumin was observed. Results The survival rate of only 50 mg/L curcumin for 24 h was lower than that of the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no significant difference between the other concentrations and time of curcumin group and the control group（P>0.05）. The expression levels of SR-B1， TRAF6， NF-κB and IRAK1 mRNA in the 50 mg/L curcumin group were significantly lower than those in the other groups， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The expression level of the above indicators in the 25 mg/L curcumin group was lower than that of the 12.5 mg/L curcumin group and control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference between the 12.5 mg/L curcumin group and the control group in the above indicators （P>0.05）. Conclusion Certain concentration of curcumin can inhibit the expression of SR-B1， TRAF6， NF-κB and IRAK1 mRNA in THP-1 derived macrophage foam cells， thereby reducing foam cells and achieving anti-atherosclerosis.

[Key words] Curcumin;THP-1-derived macrophage foam cells;SR-B1

動脉粥样硬化（AS）是目前冠心病、心肌梗死、脑出血、脑梗死等常见心脑血管疾病的主要原因[1]。研究显示[2]，脂质在巨噬细胞中聚集成泡沫细胞，是AS发生发展的重要病理特征，因此如何抑制脂质的积累，减少泡沫细胞的形成是防治AS的关键。姜黄素中含有姜黄成分，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗性、调脂、保护血管内皮等作用[3]。目前大量研究显示[4-5]，姜黄素具有抗AS的作用，多数学者认为这是由于姜黄素具有显著调脂作用，参与调解胆固醇的摄入和流出，从而减少泡沫细胞的形成。因此本文通过研究姜黄素对THP-1源性巨噬泡沫细胞SR-B1表达的影响，从而探讨姜黄素在抗动脉粥样硬化中的作用和机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采用由中科院上海细胞生物所细胞中心提供的THP-1源性巨噬泡沫細胞;由美国Gibco公司提供的RPMI1640培养基;立陶宛Fermentas公司生产的逆转录试剂盒;北京百泰克生物科技有限公司提供的TRIzol试剂盒。由上海生工生物工程有限公司合成的SR-B1引物序列。新生牛血清购自四季青生物工程材料有限公司。姜黄素（LPS）由美国Sigma公司提供。由广州市锐博生物科技有限公司合成的siRNA。

1.2 方法

1.2.1 低密度脂蛋白的分离、氧化修饰及鉴定  采用序列超速离心法制备LDL，采用10 μmol/L CuSO4氧化修饰成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），采用0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定修饰程度，过滤除菌，4℃保存备用。

1.2.2 细胞培养  采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养THP-1细胞，于37℃下5% CO2培养箱中静置培养。每3天传代1次。传代后第1天收集细胞，以4×106个接种于25 cm2培养瓶中，每个培养瓶含8 mL培养基，再加入100 μmol/L佛波酯8 μL，使PMA终浓度为100 nmol/L。于37℃下5% CO2的培养箱中培养3 d，显微镜下观察细胞呈贴壁状态，形状不规则并有伪足伸出，证实THP-1已分化为巨噬细胞。

1.2.3 油红O染色  将细胞培养于放有无菌盖玻片的6孔培养基中，处理后用PBS缓冲液冲洗3次，5 min/次。50%异丙醇固定1 min，油红O染色液染色10 min，苏木素染色2 min，盐酸酒精粉色6 s，水性封片剂封片。

1.2.4 不同浓度姜黄素对THP-1细胞的作用  将THP-1细胞按每孔1×106个/mL接种于培养板，每个孔加入不同浓度姜黄素，分别为12.5 mg/L、25 mg/L以及50 mg/L，以空白组作为阴性对照组，在不同时间段观察THP-1细胞存活情况。

1.2.5 RT-PCR分析THP-1细胞中SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表达  将THP-1源性巨噬泡沫细胞按Invitrogen公司的Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测RNA浓度、纯度。2 μg总RNA逆转录为cDNA，取1 μL逆转录产物进行PCR循环，94℃下预变4 min，94℃下变性1 min，59℃下退火1 min，72℃选延伸1 min，72℃下延伸10 min。共进行34个循环。SR-B1引物序列，上游引物：5"-AATCCGGAGCCAAGAGAAAT-3"。下游引物：5"-TCCCTGAGTGTCTGCACAAG-3"。PCR扩增产物长度为354bp。取RT-PCR产物置于1.2%琼脂糖凝胶电泳中电泳，加入10 μL反应产物，内参加样量3 μL，溴化乙锭染色。电泳带使用UVP型凝胶图像分析系统进行积分吸光度测定。参照Genebank设计合成TRAF6、NF-κB以及IRAK1引物。PCR反应采用两步温控法。TRAF6退火温度62℃，循环次数40次，PCR扩增产物长度为374bp。TRAF6上游引物：5"-TTGGCTGAGCGGAGTCGT-3"。下游引物：5"-GCAGGCTTTGCAGAACCTAT-3"。NF-κB退火温度60℃，循环次数25次，PCR扩增产物长度为945bp。NF-κB上游引物：5"-GAGGTGTATTTCACGGGACC-3"。下游引物：5"-GAAGTCCATGTCCGCAATGG-3"。IRAK1退火温度59℃，循环次数40次，PCR扩增产物长度为107bp。IRAK1上游引物：5"-AGTTGGGAGCATGGC-AGAC-3"。下游引物：5"-CGCAAGAGGACACTCG-GGACC-3"。反应产物在含有1 mg/L溴化乙啶的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压100 V。采用相关软件扫描电泳带吸光度值，计算镉浓度药物对目的基因mRNA的表达抑制率。上述实验均重复三次取平均值。

1.3 观察指标

观察三组不同浓度姜黄素及对照组作用6 h、12 h及24 h时对THP-1源性巨噬泡沫细胞存活率的影响。分析三组不同浓度姜黄素和对照组中SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA的表达水平。细胞存活率=姜黄素作用后细胞计数/姜黄素作用前细胞计数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件，计数资料用百分比表示，采用χ2检验，计量资料用（x±s）表示，采用t检验，多组间资料对比采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度姜黄素及对照组不同时间对THP-1源性巨噬泡沫细胞存活率的影响

仅50 mg/L姜黄素作用24 h细胞存活率低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;其他浓度及时间姜黄素组细胞存活率与对照组对比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 姜黄素对THP-1细胞SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表达的影响

50 mg/L姜黄素组SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表达水平明显低于其他组，差异有统计学意义（P<0.05）;25 mg/L姜黄素组上述指标表达水平低于12.5 mg/L姜黄素组和对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;12.5 mg/L姜黄素组与对照组上述指标表达水平对比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

近年来随着我国人口老龄化的加剧以及人们生活习惯的改变，AS发生率不断升高，引起专家学者的关注和重视[6]。虽然AS的发病机制尚未完全明确，但大部分学者认为AS的发生发展与脂质沉积、氧化修饰、炎症反应等有关[7-8]。血脂代谢经过氧化修饰后形成的ox-LDL极易引起血管内皮损伤，导致胆固醇在内皮下沉积，引起巨噬细胞的迁移和吞噬，脂质在巨噬细胞中形成泡沫细胞是引起AS的主要原因之一[9-10]。因此抑制脂质积累、减少泡沫细胞的形成成为防治AS的关键。

巨噬泡沫细胞主要依靠SR-B1等因子的逆转录，从而排出胆固醇[11]。SR-B1是HDL中胆固醇逆转运的重要受体，参与了人体内胆固醇逆向转运过程。SR-B1抗AS的机制可能为：①介导肝脏吸收和HDL胆固醇的胆汁分泌，调节胆固醇的逆转运，抑制AS的发生和发展[12];②AS斑块上巨噬泡沫细胞中SR-B1的表达也会影响HDL和细胞间胆固醇的流出[13];③可能抑制了血浆动脉粥样脂蛋白积累[14];④SR-B1的表达可能控制血红细胞的成熟，预防机体贫血[15]。因此SR-B1因子的表达可能影响了脂蛋白的代谢，对AS的发生发展具有重要影响。

姜黄素中主要成分为姜黄，有较广泛的药理作用，包括抗氧化、抗炎、降血压、保护血管内皮、调脂等。AS与氧化反应、炎症反应等密切相关[16]。而姜黄素在临床上被证实具有抗AS作用。因此姜黄素抗AS作用的机制可能为：①通过调节LDL受体，降低血液中胆固醇水平[17];②姜黄素能调节载脂蛋白B（apoB）的表达，使apoB表达为血浆清除更快的apoB48亚型，减少apoB表达为血浆清除较慢的apoB100亚型和LDL-C[18];③姜黄素可能通过NF-κB、TLR4等通路影响SR-A1、SR-B1的表达水平，从而参与胆固醇的调节[19]。在本研究中，采用三组不同浓度的姜黄素对THP-1源性巨噬泡沫细胞进行处理，以空白组作为对照，结果显示，50 mg/L浓度的姜黄素处理24 h，THP-1源性巨噬泡沫细胞存活率明显降低，而其他浓度及时间的细胞存活率与对照组并无差异，结果提示50 mg/L以姜黄素12 h内对THP-1源性巨噬泡沫细胞基本无毒性。在观察姜黄素对THP-1细胞SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表达的影响时发现，50 mg/L姜黄素组SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA表达水平明显低于其他组;25 mg/L姜黄素组上述指标表达水平低于12.5 mg/L姜黄素组和对照组;12.5 mg/L姜黄素组与对照组上述指标表达水平无差异。结果表明12.5 mg/L姜黄素对上述细胞因子的表达水平基本无影响，而超过12.5 mg/L浓度的姜黄素对上述基因表达水平具有明显抑制作用。提示姜黄素可能通过抑制SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA的表达水平，从而对THP-1源性巨噬泡沫细胞产生杀伤作用，起到抗AS的作用[20]。

综上所述，一定浓度姜黄素可抑制THP-1源性巨噬泡沫细胞中SR-B1、TRAF6、NF-κB以及IRAK1 mRNA的表达，从而减少泡沫细胞，达到抗动脉粥样硬化的目的。

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（收稿日期：2018-10-29）