摘要：采用温室盆栽试验的方法，研究3株对黄瓜枯萎病具有较强抑制作用的芽孢杆菌（Bacillus subtilis） B579、Bacillus subtilis 2-1、Bacillus amyloliquefaciens 9-2对黄瓜根际土壤关键酶活性的影响。结果表明，生防菌的施入能明显提高黄瓜根际土壤中碱性磷酸酶、过氧化氢酶、几丁质酶和脲酶等4种与土壤肥力相关酶的活性。其中，生防菌处理的酶活性最高，其次为拮抗处理和空白对照处理，病原菌处理的酶活性最低。因此，生防菌处理不仅对黄瓜具有防病促生长的作用，同时还能提高土壤关键酶活性，增加土壤肥力，为今后生态环保型生防菌剂的开发和利用奠定了理论基础。
关键词：生防芽孢杆菌;土壤酶活性;黄瓜枯萎病;土壤肥力
中图分类号： S476+.9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）07-0108-03
黄瓜枯萎病是一种严重危害黄瓜的土传性真菌病害[1]，其病原为镰孢菌属的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），病菌主要侵入幼根或伤口，使瓜叶迅速萎蔫。一般苗圃黄瓜的枯萎病发病率为20%～50%，严重的可达80%以上。土壤是农业生态系统中的枢纽[2]，负责物质与能量交换，而土壤酶作为土壤中具有高度催化作用的蛋白质，主导着土壤中与物质和能量转化有关的生物化学过程[3]。土壤酶的生物活性指标一直是土壤酶学研究的重点，并逐渐成为土壤微生物生态效应研究的重要方向和领域[4-7]。土壤酶活性的高低可较有效地反映土壤中各种生化反应的强度和方向，代表着土壤中物质代谢的旺盛程度，是土壤肥力的重要指标[8]。脲酶是土壤中最活跃的水解酶类，是广泛存在于细菌、真菌和高等植物中的酰胺酶，与土壤的微生物数量、有机质含量等密切相关，能水解土壤中的尿素，释放出供作物利用的铵，其活性与土壤肥力水平显著相关[9]。土壤过氧化氢酶活性与土壤的呼吸强度及土壤微生物活动相关，是重要的土壤微生态环境指示因子，可以表现出土壤氧化还原的能力[10]，能有效防止过氧化氢的毒害[11]。碱性磷酸酶属于水解酶类，土壤中的有机磷在土壤磷酸酶的酶促作用下才能转化为可利用的形态[12]。几丁质酶参与土壤有机碳和氮的转化，可以将几丁质转化为氨基糖，是土壤中矿质氮的主要来源[13-14]。
芽孢杆菌是一类好氧和兼性厌氧的革兰氏阳性菌[15]，对植物生长具有促进作用，可以将物质转化为营养成分供给植物或者刺激土壤中微生物的繁殖以增强土壤肥力，使植物处于良好的生长状态[16]。目前已有的研究大多是仅针对生防菌提高根际土壤中关键酶活性来进行的，本研究中引入枯萎病病菌进行生防菌的拮抗性试验。前期研究表明[17-19]，3株生防菌的施入不仅具有防病促生长的作用，同时还能提高根际土壤中微生物类群的多样性。因此，本研究将进一步揭示3株生防芽孢杆菌对黄瓜根际土壤中4种关键酶活性的影响，为今后生防芽孢杆菌菌株在农业生产中的作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于聊城大学试验田进行，供试黄瓜品种为津优1号。供试菌株为枯萎病病菌（Fusarium oxysporum），由天津科润黄瓜研究所分离保存;芽孢杆菌B579、2-1、9-2等3株生防菌株均由笔者所在实验室分离并保存。枯草芽孢杆菌B579从天津近郊蔬菜种植区根围土分离所得，温室盆栽试验表明，它对黄瓜枯萎病有显著的抑制作用，并能促进植物生长;枯草芽孢杆菌2-1从聊城市茌平县杜郎口镇中药材种植基地感染根腐病的丹参根际土壤筛选分离得到，对丹参根腐病具有生物防治作用;解淀粉芽孢杆菌9-2从聊城本地感染根腐病的中药材天南星的根际土壤中筛选分离得到，对天南星根腐病具有较好的生物防治作用。枯萎病病菌采用PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基进行培养;芽孢杆菌的培养采用LB液体和固体培养基。 酶活性测定选用天根生化科技（北京）有限公司生产的土壤酶活性测定试剂盒。
1.2 方法
1.2.1 菌液培養 （1）芽孢杆菌菌液培养：将斜面保藏的生防芽孢杆菌B579、2-1、9-2菌种分别转入内装30 mL LB液体培养基的250 mL 三角瓶中，恒温振荡培养箱中于37 ℃、180 r/min 培养15～16 h，获得种子液。将1%种子液接种于内装100 mL LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃条件下180 r/min恒温振荡15～16 h，培养结束后将菌液制备成 1×106 CFU/mL的发酵液[18]。（2）枯萎病病菌菌液培养：将枯萎病病菌FO在PDA培养基上培养至产生明显孢子，用无菌水制备成浓度为1×106 个/mL的孢子悬液。
1.2.2 试验处理 春季培养黄瓜幼苗至2～3张真叶，将幼苗移栽至直径为30 cm、高为30 cm的花盆中，每盆2～3株幼苗，共计48盆。共设置8组处理，每组6个平行，分别为：① 空白处理（CK），清水浇灌;② 枯萎病病菌处理，枯萎病病菌FO菌液浇灌;③ B579处理，B579菌液浇灌;④ B579+FO拮抗处理，B579菌液+枯萎病病菌FO菌液等量浇灌;⑤ 2-1处理，2-1 菌液浇灌;⑥2-1+FO拮抗处理，2-1菌液+枯萎病病菌FO菌液等量浇灌;⑦ 9-2处理，9-2菌液浇灌;⑧ 9-2+FO拮抗处理，9-2菌液+枯萎病病菌FO菌液等量浇灌。①组浇灌清水50 mL，②③⑤⑦组接种量50 mL，④⑥⑧组接种量为生防菌液与枯萎病病菌菌液各50 mL。
1.2.3 菌液灌根处理 在黄瓜根部进行菌液灌根处理。黄瓜在自然条件下，生长周期为90～120 d，其生长发育一般经历发芽期、幼苗期、初花期和结果期4个阶段。因此每盆黄瓜从进行菌液浇灌之日算起，分别在4、8、12和16周在各株黄瓜根际土壤约5～15 cm深处取样，测定土壤碱性磷酸酶（ALP）、过氧化氢酶（AT）、几丁质酶、脲酶（UE）4种不同酶活性。
2 结果与分析
2.1 不同时期不同处理对黄瓜根际土壤中碱性磷酸酶活性的影响
由图1可知，生防菌处理（B579、2-1、9-2）酶活性变化趋势与空白处理相似，均为在处理后4周和8周升高，在12周和16周降低，即变化趋势为先升高后降低，且生防菌处理在16周时碱性磷酸酶活性均明显高于空白处理组，其次为3组拮抗处理，枯萎病病菌FO处理酶活性最低，并且生防菌处理8周后酶活性逐渐降低，因此生防菌在碱性磷酸酶的酶活性中体现出其最佳使用周期为8周。
2.2 不同时期不同处理对黄瓜根际土壤中过氧化氢酶活性的影响
由图2可知，空白处理组与生防菌B579、2-1和9-2处理基本都为先升高再降低的趋势，这4种处理酶活性在整个生长期都处于较高状态，且在处理12周时均为最高酶活性，而后3种处理在整个生长周期的酶活性均略高于对照，考虑为生防菌益生作用的结果。在8组处理的不同时期，FO处理组过氧化氢酶活性均处于最低状态。FO处理与B579+FO，2-1+FO拮抗处理酶活性均处于先降低再升高再降低的趋势，而9-2+FO拮抗处理则与生防菌处理组变化趋势相同，含FO的4种处理最后的过氧化氢酶活性基本相同。此结果的原因考虑为在黄瓜的生长过程中生防菌对FO病菌的拮抗作用由强变弱直至消失，对产生过氧化氢酶的微生物影响力逐渐减小，故4种处理过氧化氢酶活性在16周时基本相同。由此可见，由生防菌处理的黄瓜植株根际土壤过氧化氢酶活性在整个处理期均处于较高状态，且其最佳使用周期为12周。拮抗处理组酶活性相对较低，但介于生防菌处理组与对照处理组之间，表明生防菌对土壤根际的过氧化氢酶活性能产生积极影响。
2.3 不同时期不同处理对黄瓜根际土壤中几丁质酶活性的影响
由图3可知，空白处理组的几丁质酶活性变化趋势为先升高再降低，而其他7组处理的酶活性变化趋势为先升高再降低再升高。FO处理组在16周的酶活性仍低于同时期对照的酶活性。在生防菌（B579、2-1、9-2）处理和生防菌+FO（B579+FO、2-1+FO、9-2+FO）拮抗处理的比较中可以明显看出，生防菌处理各时期几丁质的酶活性均高于相应拮抗处理同时期的酶活性（除8周时的9-2）。由此可见，各处理与空白处理对于黄瓜根际土壤中的几丁质酶活性变化趋势无太大相似性，而FO处理与各生防菌处理、拮抗处理组具有相同趋势，且FO处理组的酶活性在各个时期仍为最低，并且生防菌处理8周后酶活性均明显降低。
2.4 不同时期不同处理对黄瓜根际土壤中脲酶活性的影响
由图4可知，在处理4周时空白处理组和生防菌处理土壤脲酶活性均较高，且在4个处理中的变化趋势为先升高再降低再升高。而FO处理与各拮抗处理在4周时土壤脲酶活性均较低，且在4个处理中的变化趋势基本与前面4组相似，即同为先升高再降低再升高，且8组处理在16周时根际土壤中脲酶活性均处于较高状态。
3 讨论
研究表明，3种生防芽孢杆菌B579、2-1、9-2均能提高黄瓜根际土壤的酶活性。在黄瓜根际施加生防芽孢杆菌菌液后，仅施加生防菌的3组处理的4种酶活性与空白处理的酶活性相比结果如下：仅施加生防菌的3个不同处理组各个取样时期的碱性磷酸酶活性明显高于对照;不同取样时期过氧化氢酶活性均略高于空白处理，这一结果与曾庆宾等对微生物菌剂对烤烟根际土壤过氧化氢酶活性的研究结果[20]一致，而刘素慧等在EM（有效微生物）对连作大蒜根际土壤酶活性的影响中也得出了相似结论[21];各生防菌处理不同时期的几丁质酶活性相较于空白处理组在总体上同样偏高;各生防菌处理组不同时期的脲酶活性与空白处理组相比均有提高，且其变化趋势与尹淑丽等不同生防菌对黄瓜根际土壤酶活性的研究结果[1]一致。因此，总体上来说，生防芽孢杆菌可提高黄瓜土壤根际的4种不同土壤酶的活性，同时可说明生防菌对于植株的生长具有促生作用。
在用枯萎病病菌FO处理后，可明显发现FO处理组不同时期的4种酶活性相较于空白处理組均明显降低。而各拮抗处理组的酶活性与FO处理组相比较的情况如下：不同时期的B579+FO、2-1+FO与9-2+FO 3组拮抗处理的碱性磷酸酶活性均明显高于FO处理，且这3组处理的碱性磷酸酶活性高于空白处理组，低于对应的仅加入生防菌的处理组，表明生防菌对于施加了枯萎病病菌的黄瓜根际土壤中碱性磷酸酶活性有较大影响;这3组处理不同时期的过氧化氢酶活性明显高于FO处理组但低于空白处理组;拮抗处理组不同时期的几丁质酶活性相较于FO处理组的变化与碱性磷酸酶活性相似，这与王倡宪等对黄瓜苗期根系抗病相关酶活性的研究结果[22]相似;拮抗处理组不同时期的脲酶活性无明显规律性，但总体能看出施加生防菌的FO的处理组脲酶活性较仅施加FO处理组高。根据4种不同酶活性的变化，在FO病菌存在的前提下，施加生防菌可提高黄瓜根际土壤的酶活性，联系笔者所在实验室前期研究[17，23]，说明生防菌对于枯萎病病菌存在较明显的拮抗作用。但对于生防菌防病促生长作用的机制仍需要进一步的研究。
4 结论
在植株根际土壤中施入生防芽孢杆菌菌株可以提高土壤中的酶活性，从而可改善土壤结构，增强土壤肥力，有利于土壤的健康发展。本研究通过设置多种对照处理研究不同生防菌对不同土壤酶活性的影响程度，表明生防菌不仅在植株生长发育过程中起到促生作用，而且对可能存在的致病菌起到拮抗作用，能有效防止枯萎病的发生，为今后生态环保型生防菌剂的开发和利用奠定了理论基础。
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