摘 要：以松针为原料，采用双酶法-超声辅助提取法研究优化松针多糖的提取工艺。以料液比、超声温度、超声时间、复合酶添加量及酶解时间为因素，研究其对松针多糖提取率的影响，并通过正交试验优化工艺参数。结果表明，料液比、超声温度、超声时间、复合酶的添加量和酶解时间等因素对松针多糖的提取率有明显的影响作用；当料液比为1∶25，超声温度60℃，超声时间25min，复合酶（纤维素∶果胶酶=1∶1）添加量5%，酶解时间2h时，松针多糖的提取率最高，为3.97%。
关键词：松针；多糖；工艺优化
中图分类号 TQ461 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）07-0019-04
松针为松科植物松属植物的叶，别名猪鬃松叶、松毛、山松须[1]，是松属类植物的主要副产物之一[2]，是一种分布广泛、生长速度快的天然可再生资源[3]，含有多种营养物质和活性物质，具有很高的营养價值和药用价值[2，4]，食用历史悠久[5-7]。雪松是可供药用的13种松树之一[8]，针叶药用历史悠久。松针主要化学成分为挥发油、黄酮类、苯丙素类、有机酸类、三萜类、甾体类、多糖及针叶胶类等[9，10]，其活性成分的多样性使其具有抗氧化、抑菌防腐、降糖降血脂、抗癌和护肝的功效[11]。随着现代研究的不断深入，松针的药用价值和营养价值日益受到关注[12]，当前松针提取物在医药和食品方面的开发利用价值逐渐受到重视，工业开发潜力巨大[13]。为此，笔者开展了优化双酶法-超声辅助提取松针多糖工艺的研究，以期为松针的综合深加工利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与设备 材料：松针，2018年4月份于采自商洛，纤维素酶（400U/mg）、果胶酶（500U/mg），其余试剂均为分析纯。仪器：UV-1100型紫外分光光度仪（上海美析仪器有限公司）；R-1002型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；KH5200E型超声波清洗器（昆山乐创超声仪器有限公司）；SI-234型电子天平（丹佛仪器有限公司）；SHZ-D型抽滤机（巩义市子华仪器有限责任公司）；LJYE-100型恒温水浴锅（北京科伟仪器有限公司）；TDL-40B型大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 松针多糖的提取方法 采集新鲜雪松松针，经干燥粉碎后，过筛，分别用石油醚、95%乙醇处理，减压抽滤后烘干，取过40目筛预处理松针粉末1g，按1∶25的料液比加入蒸馏水，充分混合，进行超声处理（50℃，20min），然后在纤维素酶：果胶酶=1∶1条件下添加量为4%，酶解2h，酶解结束后抽滤，向滤液中加入5倍体积95%乙醇，并在4℃条件下静置5h，随后取出离心（4000r/min，15min），将沉淀物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥后得松针多糖粗品[14]。
1.2.2 单因素实验 按照1.2.1的方法，分别在料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，超声温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，超声时间为10min、15min、20min、25min、30min，复合酶（纤维素酶∶果胶酶=1∶1）的添加量为2%、3%、4%、5%、6%，酶解时间为1h、1.5h、2h、2.5h、3h的条件下提取松针多糖，考察其对松针多糖提取率的影响。
1.2.3 正交试验 在单因素试验的基础上，选取合适的因素水平进行正交实验，以松针多糖提取率为考察指标，优化提取工艺。
1.3 松针多糖的含量测定
1.3.1 标准曲线的制备 精确称取20mg在105℃干燥至恒重的葡萄糖于500mL容量瓶中，加蒸馏水摇匀定容，分别取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6mL于试管中，加蒸馏水补至2mL，再各加入6%苯酚1mL及浓硫酸5.0mL，充分混合冷却，室温静置20min，于490nm处测定其吸光值，绘制标准曲线[15]。
1.3.2 松针多糖提取率的测定 按照1.2.1的方法提取的松针粗多糖复溶，并定容于50mL容量瓶中，吸取0.1mL按1.3.1的方法采用苯酚-硫酸法测吸光度，通过线性方程计算松针多糖浓质量。多糖的提取率计算公式为：
松针多糖提取率（%）=松针多糖质量/松针质量×100
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线 按1.2.3的方法进行葡萄糖标准曲线的制备，结果见图1。
2.2 单因素实验
2.2.1 料液比对松针多糖提取率的影响 由图2可知，料液比对松针多糖的提取影响显著。当料液比在1∶10～
1∶30时，随料液比的增大整体呈现先上升后下降的趋势，且当料液比为1∶25时达到最高，为1.97%。这可能是当料液比较低时，多糖随溶剂量的增大，溶出量增大，多糖提取率升高，当溶剂量增大到一定程度时，导致底物浓度过低，多糖溶出减慢，同时其他杂质溶出增加，导致多糖提取率降低。
2.2.2 超声温度对松针多糖提取率的影响 由图3可知，超声温度对松针多糖的提取影响显著。当超声温度为30～60℃时，松针多糖的提取率随超声温度的升高呈上升趋势，并于60℃达到最大，松针多糖提取率为2.41%；当超声温度高于60℃后，随温度继续上升，多糖提取率呈现下降趋势。这可能是由于在一定的温度方位内，随温度的升高，加快了松针多糖溶出，使得多糖提取率明显升高，但当温度过高时，多糖糖苷键也可能断裂、失活，导致多糖提取率降低[16]。
2.2.3 超声时间对松针多糖提取率的影响 由图4可知，超声时间对松针多糖的提取影响显著，随超声时间的延长，整体呈现先上升后下降的趋势。当超声时间为10～25min时，随超声时间的延长，松针多糖的提取率呈上升趋势，且当超声时间为25min时，提取率达到最大值，为1.15%；当超声时间大于25min后，松针多糖的提取率呈下降趋势。这可能是随超声时间的延长，超声的空穴效应使细胞壁进一步破碎，导致多糖溶出物不断增加，多糖提取率逐渐上升，但当提取时间过长，超声空穴作用会造成提取液中多糖结构受到破坏，导致多糖提取率下降。
2.2.4 复合酶添加量对松针多糖提取率的影响 由图5可知，复合酶浓度对松针多糖提取率有显著影响，随复合酶浓度的增大松针多糖的提取率呈上升趋势。当复合酶浓度为2%～5%时，随复合酶浓度的增大松针多糖的提取率显著上升；当复合酶浓度大于5%后，松针多糖的提取率变化相对较小，上升趋势减弱。这可能是当酶的添加量达到一定程度后，已接近饱和，继续增大酶使用量并不能进一步提升反应的速率。
2.2.5 酶解时间对松针多糖提取率的影响 由图6可知，酶解时间对松针多糖的提取影响显著。当酶解时间为1～2h时，随着酶解时间的延长松针多糖的提取率呈上升趋势，当酶解时间为2h时，提取率达到最高，为2.24%；当酶解时间大于2h后，松针多糖的提取率呈微弱下降的趋势。这可能由于随酶解处理时间的延长，有助于酶与底物接触，有效促使多糖的溶出；但随时间的继续延长，因底物的消耗，导致松针多糖的提取率变化不大甚至略有下降。
2.3 正交实验结果 在单因素实验基础上，以松针多糖提取率为考察指标，选取对松针多糖提取率影响较大的因素：料液比、超声温度、超声时间、复合酶浓度、酶解时间为考察因素进行正交实验，优化提取工艺参数，结果如表1所示。由表1可知，各因素影响松针多糖提取率的主次顺序为C>A>B>E>D，即复合酶浓度>超声温度>超生时间>料液比>酶解时间，最优水平组合A3B3C3D2E3，即料液比1∶25、超声温度60℃、超声时间25min、复合酶（纤维素∶果胶酶=1∶1）添加量为5%、酶解时间2h。利用最佳工艺参数，进行验证实验，平行实验3次，测得松针多糖的提取率为3.97%。
3 结论
采用双酶法-超声辅助提取松针多糖，结果表明，料液比、超声温度、超声时间、复合酶添加量及酶解时间对松针多糖的提取有一定的影响。利用双酶法-超声辅助提取松针多糖时，当料液比为1∶25，超声温度60℃，超声时间25min，复合酶（纤维素∶果胶酶=1∶1）添加量5%，酶解时间2h时，松针多糖的提取率最高，为3.97%。
参考文献
[1]董朱，范辉，王良萍.松针抗肿瘤作用机制的研究进展[J].中国中医药科技，2018，25（02）：307-309.
[2]邱冰，胡惠静.松针在医药中的研究进展[J].中医药信息，2017，34（06）：130-133.
[3]郝金伟，张国锋，容井容，等.松针精油的提取及开发利用的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2018，9（23）：6118-6123.
[4]王群.几种松科植物活性成分及多酚抗氧化性能力的研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2016.
[5]张晋蔚，钱江，何玉巧，等.松针提取液对慢性便秘小鼠肠道抗氧化能力及通便作用的影响[J].食品工业科技，2014，35（21）：351-353，357.
[6]胡钧，吕圭源，李万里，等.马尾松松针提取物保健及药用价值研究[J].林产化工通讯，1992（06）：10-11.
[7]黄顺东.松针临床应用及药理研究概况[J].实用中医药杂志，2005（08）：514-515.
[8]刘东彦，张莉霞，石晓峰，等.雪松松针中莽草酸和多糖的提取工艺研究[J].中药材，2017，40（08）：1914-1916.
[9]马趣环，石晓峰，沈薇，等.响应面分析法优化雪松松针多糖提取工艺研究[J].中华中医药杂志，2018，33（03）：1106-1110.
[10]白朝辉，石晓峰，刘东彦，等.雪松松针的化学成分及药理作用研究概述.中国药师，2012，15（12）：1791-1793
[11]刘康柯，曹小燕.松针有效成分提取及药理活性研究进展[J].广州化工，2018，46（13）：6-8.
[12]龚恒佩，刘祖望，陈妍月，等.松针的显微及分子鉴别研究[J].浙江大学学报（医学版），2018，47（03）：300-306.
[13]李丹苏. 松针抗菌物的分离提取及其活性研究[D].吉林：吉林农业大学，2015.
[14]许小向，尹小莉，洪艳平，等.火炬松松针多糖提取工艺及其抗氧化性研究[J].林产化学与工业，2016，36（03）：114-120.
[15]许小向，洪艳平，胡捷敏，等.松针多糖提取工艺及稳定性研究[J].食品科技，2015（06）：218-223.
[16]李恒，李莉梅，何春梅，等. 野生仙人掌多糖提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2015，36（4）：210-214.
（責编：张宏民）
相关热词搜索： 松针 多糖 超声 提取 辅助
