复方丹参滴丸抗急性心肌梗死代谢组学研究

��h?�4�h��ɋ�H6�]5�ɷ�i�۝4�D���馝�٨ky"http://www.hbzzbh.com/k/fangan/" target="_blank" class="keylink">方案及样本收集 实验大鼠随机分为3组，假手术对照组（Sham）、模型组（Model）和治疗组（Treatment），每组各10只。为研究复方丹参滴丸抗急性心肌梗死作用，治疗组在造模前6天和造模当天，每天灌胃给药，给药剂量根据临床用药剂量折算，以0.8 g/（day·kg）鼠重的剂量，给予复方丹参滴丸。假手术对照组及模型组分别灌胃给予相当剂量生理盐水。实验动物在造模24 h后脱颈处死，眼眶取血1.5 mL，置于涂有肝素的EP管内，3500 r/min离心15 min，于

Symbolm@@ 80℃保存备用。取血后收集心肌缺血区组织（梗死区和正常区中间），用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗去除血细胞后，在液氮中速冻，于

Symbolm@@ 80℃保存备用。

2.3.3 血浆样本前处理 血浆于0℃冰水混合物中解冻，用移液枪精确量取100 μL血浆样品，加入300 μL冰甲醇，涡旋振荡混合均匀2 min，12000 r/min离心5 min，取上清液直接用于液相色谱质谱分析。将所有样品各取50 μL混合作为质控样品（Quality control， QC），包含所有样品的特征，力求反映整体样品的状况，可用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。

2.4 样品测定

2.4.1 色谱条件 采用Waters Acquity BEH C8色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.4 mL/min，柱溫35℃，进样量5 μL，梯度洗脱程序： 0～1 min，5% B； 1～5 min，5%～50% B； 5～10 min，50%～80% B； 10～11 min，80%～100% B，11～12 min，100% B，平衡时间为3 min。

2.4.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），在正负两种模式下进行测定，数据采集模式为MSE棒状图（Centroid）模式，交替切换低碰撞能与高碰撞能，可同时获得一级质谱图和二级质谱图[10]。参数如下： 毛细管电压正模式3.0 kV，负模式2.3 kV； 锥孔电压30 V； 离子源温度120℃； 脱溶剂气温度500℃； 锥孔气流量50 L/h； 脱溶剂气流量800 L/h； 碰撞电压范围19～45 V； 采样频率0.1 s； 质量数检测范围m/z 50～1200； 内参校准液使用亮氨酸脑啡肽（＼[M + H＼]+ （m/z 556.2771），＼[M-H＼]-（m/z 5542615）），浓度2 ng/μL，流速10 μL/min。

2.4.3 分析顺序 分析样品前测试空白溶剂样品，保证色谱柱及系统中无残留污染物干扰。连续进样10次QC样品， 用于评估方法的重复性，样品测试顺序随机，并将QC样品穿插于分析样品中作为评估分析批次稳定性的依据。

2.5 数据分析

将所有的液相色谱质谱数据导入Waters 公司Markerlynx 软件（version4.1， Waters Corp， Milford， USA）， 进行色谱峰自动识别提取和峰匹配，将数据结果矩阵以CSV格式导出，再将数据导入Metaboanalyst 3.0 （http：//www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml），对数据矩阵进行归一化（Normalization）、立方根数据转换（Cube root transformation）、Pareto标尺化（Scaling）等处理，以减少变量方差异性，增加数据间的可比性。通过构建非监督主成分分析（Principal component analysis， PCA）， 考察各组血浆样本间整体代谢变化情况； 构建有监督模式的偏最小二乘判别分析（Partial least squaresdiscriminant analysis， PLSDA）模型，鉴别模型中对于区分各组间代谢轮廓差异贡献较大的代谢物，初步筛选出具有潜在可能性的内源性代谢物。

3 结果与讨论

3.1 病理学评价

以心电图（Electrocardiogram， ECG）ST段显著抬高作为衡量造模成功与否的标志。如图1所示，从ECG中对比Sham组可见， 造模后出现ST段显著抬高及病理性Q波，而治疗组虽然依然处于ST抬高状态，但未见明显病理性Q波。

为检测CDDP对组织形态的影响，取造模后心肌组织， 用H&E染色观察心肌组织的形态变化。典型形态如图1所示，Sham组显示了正常状态下心肌组织的形态结构； Model组心肌出现明显损伤，表现为部分心肌纤维结构破坏、心肌细胞间质水肿和少量炎症细胞浸润； 而提前给予CDDP进行干预，造模后心肌组织损伤明显减轻，仅发生少量轻度间质水肿。

3.2 质控样本分析

对建立的UPLCQTOF/MS方法进行稳定性和重复性方法学评价。正负模式下各选择5个不同极性的离子进行方法学评价。分别对选择的10个离子的保留时间和峰面积进行检测（表1）。在正模式下保留时间的相对标准偏差（RSD）<0.22%，峰面积的方法重复性及稳定性评价RSD分别为2.43%～7.14%及1.93%～3.19%； 在负模式下， 保留时间的RSD<0.70%，峰面积的方法重复性及稳定性评价RSD分别为1.28%～2.59%及2.20%～5.93%。以上结果表明， 本方法重复性高，稳定性好，可以用于进行批量的代谢组学实验。

3.3 AMI差异代谢物筛选

在正负模式下， 分别对假手术对照组和模型组的数据建立PCA模型，从得分图（图2）中可以发现两组样品分别聚合到一起， 并得到了明显分离，说明在AMI造模后大鼠血浆中内源性代谢物轮廓发生了显著异常。 将两组数据建立PLSDA模型，使用交叉验证的两个参数R2和Q2进行评价，R2表示模型的方差大小和拟合的优良度，Q2表示模型预测值的方差大小和预测能力。正模式下，R2=0.959，Q2=0944； 负模式下，R2=0.976，Q2=0.957。表明模型具有很好的拟合性和预测能力。根据模型中代谢离子的变量投影重要性参数（Variable importance in the projection，VIP）>1初步筛选差异性变量。对所得差异性变量进行t检验，筛选出两组间相对含量存在显著性差异的变量（p<0.05）。对同时满足VIP>1和p<0.05的变量进行鉴定。

3.4 AMI差异代谢物初步鉴定

利用差异代谢物精确m/z值在HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、METLIN（http：//metlin.scripps.edu/）、KEGG （http：//www.genome.jp/kegg/）、PubChem （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、LIPID MAPS（http：//www.lipidmaps.org/）等數据库检索，结合差异代谢物质谱数据信息（加合离子、准确质荷比、保留时间、MSE二级信息），寻找信息匹配的可能代谢物。查询代谢物的描述信息及相关文献，对物质进行确认。通过标准品对部分物质进行验证，最终初步确定22种差异代谢物（表2），分别分布于甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、三羧酸循环、细胞色素P450代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯互变代谢、苯丙氨酸代谢、花生四烯酸代谢、胆汁酸代谢、脂肪酸代谢等代谢通路中， 表明AMI可能对以上通路造成影响，使整体状态失调。其中，有10种代谢物在模型组中表现为上调，12种代谢物在模型组中为下调。

3.5 复方丹参滴丸对AMI治疗作用的代谢组学分析

本研究采用代谢组学的分析方法，对大鼠血浆中的小分子代谢产物进行测定，从整体水平考察复方丹参滴丸对AMI的保护作用。分别在正负模式下对3组数据建立PCA模型（图3），从得分图中可以看出两种检测模式下复方丹参滴丸治疗组（蓝色）大鼠的整体状态已经偏离模型组（绿色），且有向Sham组（红色）状态靠近的趋势，尽管未与Sham组整体状态相交， 仍可说明复方丹参滴丸的给药对大鼠起到了预保护作用。

为进一步探讨复方丹参滴丸抗AMI的作用机制，对已鉴定的差异代谢物在复方丹参滴丸给药组的含量情况进行研究。从热图（图4）中可以直观地看出差异代谢物在每个样本中的含量高低情况。通过独立样本t检验，比较模型组与治疗组总体之间的AMI差异代谢物含量是否具有显著性差异，保留p<0.05的代谢物。结果表明，复方丹参滴丸可以不同程度地逆转AMI大鼠血浆差异代谢物，对其中的8种代谢物具有较显著的调节作用，分别是硫酸对甲苯（pTolyl Sulfate）、马尿酸（Hippuric acid）、雌马酚葡萄糖苷酸（Equol 7Oglucuronide）、溶血磷脂胆碱（16∶0）（LysoPC（16∶0））、胆酸（Cholic acid）、油酸酰胺（Oleamide）、棕榈酰胺（Palmitic amide）和鞘脂（d18∶1/16∶0）（SM（d18∶1/16∶0）），具体调节情况如图5所示。

以上差异代谢物位于苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、胆汁酸代谢和脂肪酸代谢等代谢通路中，说明复方丹参滴丸可能通过调节这些通路起到保护心肌的作用。

硫酸对甲苯、马尿酸、雌马酚葡萄糖苷酸均属于与尿毒症相关的代谢物[11]，由胃肠道微生物代谢产生，是典型的难解离蛋白结合毒素，这些物质含量的改变体现出胃肠微生物菌群的失调，与心血管疾病和氧化损伤有密切的关系[12]。 本研究发现，经AMI造模后， 这些物质含量失衡，而在复方丹参滴丸治疗组中该情况被逆转，体现出复方丹参滴丸对菌群失调的平衡作用。

溶血磷脂胆碱（Lysophosphatidylcholine， LysoPC）是磷酸卵磷酯（Phosphatidylcholine，PC）经磷脂酶A2（PLA2）作用的裂解产物，PLA2能催化磷酸卵磷酯裂解产生游离脂肪酸，而脂肪酸是内皮细胞和心肌细胞膜的重要成分，是心脏能量来源的主要物质[13]。本研究发现心肌梗死引起磷脂分解代谢紊乱，推测为AMI影响了PLA2的活性。相比Sham组，所测到的疾病状态下含不同长度脂肪酸链LysoPC的变化趋势并不统一，具体原因尚不明确，但在复方丹参滴丸组中均体现出回调趋势，其中以LysoPC（16∶0）最为显著。

胆酸是一种在肝脏中分泌合成的重要胆汁酸，属于类固醇物质。是一种强乳化剂，能促进小肠及肝脏中脂类的吸收代谢与排泄，并可以回到肝脏中被重新利用， 它与胆固醇平衡相关的关键酶调节密切相关。本研究中胆酸水平在治疗组基本被调节至正常水平，证明复方丹参滴丸可能具有改善AMI带来的胆汁酸代谢异常的功能。

油酸酰胺、棕榈酰胺均属于长链不饱和脂肪酰胺，是由机体自然产生内源性物质， 与情绪与睡眠障碍密切相关，属于中枢神经内源性大麻素系统，可与多个神经递质系统相互作用[14]，受体激活可活化血小板、刺激血小板聚集， 并与多种心血管危险因子密切相关[15]，但分子作用机制尚不明确。在治疗组中， 两物质含量水平下调，说明复方丹参滴丸的预给药可以起到调节这类物质代谢平衡的作用。

SM（d18∶1/16∶0）为鞘磷脂类物质，来源于细胞膜周围的一些神经细胞轴突髓鞘，由磷酰胆碱及神经酰胺经鞘磷脂合成酶催化产生，在信号转导过程中发挥重要作用。其与AMI的相关作用机制还需要进一步研究。本研究结果表明， 治疗组降低了AMI带来的SM（d18∶1/16∶0）含量升高的状况。

4 结 论

疾病的病理学变化常会导致机体的基础代谢产生相应改变，从而引起小分子代谢物的种类、浓度、比例等发生变化，最终造成个体间代谢轮廓的差异。代谢组学通过分析生物样本中可以反映机体状况的小分子内源性代谢物，对药物进行整体评价，适合于中药复方多通路、多途径的作用特点。

本研究采用LADCA法制作大鼠AMI模型，采用UPLCQTOF/MS方法对大鼠血浆样本进行测定，以代谢组学为分析手段，研究在复方丹参滴丸给药干预的情况下，AMI大鼠血浆中内源性代谢物变化。结果表明，复方丹参滴丸可以对筛选到的22种AMI差异代谢物中的8种有明显的回调作用，其通路涉及苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、胆汁酸代谢及脂肪酸代谢， 表明复方丹参滴丸可以通过多通路、多途径对AMI起到预保护的作用。

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Abstract An acute myocardial infarction rat model was established by ligation of the left ventricular coronary artery. Plasma samples of rats were collected and analyzed by ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole timeofflight mass spectrometry （UPLCQTOF/MS） to study the myocardial protection mechanism of compound Danshen dropping pill （CDDP）. After principal component analysis （PCA） and partial least squares discriminant analysis （PLSDA）， 22 metabolites were identified as potential biomarker of AMI. Furthermore， CDDP had remarkable effect on AMI rats. pTolyl sulfate， hippuric acid， equol 7Oglucuronide， lysoPC（16∶0）， cholic acid， oleamide， palmitic amide and SM（d18∶1/16∶0） were significantly changed in treatment group. The results showed that CDDP had a very good myocardial protection effect on AMI rats， and might influence the pathways of phenylalanine metabolism， glycerophospholipid metabolism， fatty acid metabolism， primary bile acid biosynthesis and Sphingolipid metabolism.

Keywords Compound Danshen dripping pills； Acute myocardial infarction； Metabolomics； Plasma

（Received 13 January 2017； accepted 11 April 2017）